[發(fā)明專利]一種同時表達(dá)兩條sgRNA的載體的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410605326.7
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104388456A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧倩云;周宇荀;常雪瑩;王斯佳;肖君華;李凱
• 申請（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于crRNA領(lǐng)域，特別涉及一種同時表達(dá)兩條sgRNA的載體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

1987年，日本課題組在E.coli?K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列(Ishino?Y，Shinagawa?H，Makino?K，et?al.Nucleotide?sequence?of?the?iap?gene,responsible?for?alkaline?phosphatase?isozyme?conversion?in?Escherichia?coli,and?identification?of?the?gene?produce.J?Bacteriol,1987,169(12):5429-5433)，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)這類間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古生菌的基因組中，在2002年，被科學(xué)家正式命名為規(guī)律成簇間隔短小回文重復(fù)序列(CRISPR)(Jansen?R,van?Embden?J?D,Gaastra?W,et?al.Identification?of?a?novel?family?of?sequence?repeats?among?prokaryotes.Omics:a?journal?of?Intearative?Biology,2002,6(1):23-33；Mojica?F?J,Ferrer?C,Juez?G,et?al.Long?stretches?of?short?tandem?repeats?are?present?in?the?largest?replicons?of?the?archaea?Haloferax?mediterranei?and?Haloferax?volcanii?and?could?be?involved?in?replicon?partitioning.Mol?Microbiol,1995,17(1):85-93；Jansen?R,Embden?J?D,Gaastra?W,et?al.Identification?of?genes?that?are?associated?with?DNA?repeats?in?prokaryotes.Mol?Microbiol,2002,43(6):1565-1575)。

CRISPR發(fā)現(xiàn)是一種細(xì)菌和古生菌的一種免疫系統(tǒng)，它是由一列短小的保守重復(fù)序列被具有相似大小的獨(dú)特的DNA序列所間隔，一種獨(dú)特的DNA序列叫做間隔區(qū)，這些間隔區(qū)通常來源于噬菌體或質(zhì)粒DNA。CRISPR列和Cas(CRISPR-associated)基因形成CRISPR-Cas適應(yīng)免疫系統(tǒng)(Horva?th,P.and?Barrangou,R.(2010)CRISPR/Cas,the?immune?system?of?bact?eria?and?archaea.Science?327,167–170；Barrangou,R.et?al.(2007)CRISPR?provides?acquired?resistance?against?viruses?in?prokaryotes.Science?315,1709–1712；Gasi?unas,G.et?al.(2013)Molecular?mechanisms?of?CRISPR-mediated?microbial?immunity.Cel?l?Mol.Life?Sci.http://dx.doi.or?g/10.1007/s00018-013-1438-6)。CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能是這樣行使的：將入侵的核酸片段作為間隔區(qū)合并入宿主基因組，隨后將這些間隔區(qū)作為模板，產(chǎn)生小RNA分子(crRNA)，這些crRNA能夠和Cas蛋白結(jié)合成為效應(yīng)復(fù)合物，它能夠在下一輪的侵染中將外源核酸沉默掉。