[發明專利]一種用于檢測PDGFRA基因熱點突變的核苷酸組、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410604371.0
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104328182B
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 林佳;李品;霍然;唐景峰
• 申請（專利權）人: 武漢百泰基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用于檢測PDGFRA基因突變的核苷酸組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

血小板源性生長因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)是一種單鏈跨膜蛋白，屬Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶家族。最常見的PDGFRA突變位點是編碼位于第二酪氨酸激酶區活化環的區域(exon18)，少數突變發生在近膜區(exon12)，突變引起PDGFRA蛋白的功能改變，通常會導致非配體依賴性的二聚體形成、酪氨酸殘基自主磷酸化及下游信號的激活。這種激活導致的最終結果是腫瘤的發生。

現有的檢測PDGFRA基因突變的方法有Sanger測序法，但采用Sanger測序法檢測PDGFRA基因突變時，其檢測靈敏度低，不能準確檢測出PDGFRA基因是否發生突變，使用者迫切需要一種高靈敏度的檢測方法替換Sanger測序法。

發明內容

為了解決現有技術中檢測PDGFRA基因突變的方法的靈敏度低的問題，本發明實施例提供了一種用于檢測PDGFRA基因突變的引物、探針、鎖核苷酸探針、試劑盒及檢測方法。所述技術方案如下：

一方面，本發明實施例提供了一種用于檢測PDGFRA基因突變的核苷酸組，所述核苷酸組包括用于檢測所述PDGFRA基因的第12號外顯子的引物、熒光探針和鎖核酸探針、以及用于檢測所述PDGFRA基因的第18號外顯子的引物、熒光探針和鎖核苷酸探針，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，

PDGFRA基因第12號外顯子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

PDGFRA基因第12號外顯子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

PDGFRA基因第12號外顯子的熒光探針如序列表中SEQ ID NO.3所示；

PDGFRA基因第12號外顯子突變類型為V561D的鎖核酸探針如序列表中SEQ ID NO.7所示；

PDGFRA基因第18號外顯子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；

PDGFRA基因第18號外顯子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

PDGFRA基因第18號外顯子的熒光探針如序列表中SEQ ID NO.6所示；

PDGFRA基因第18號外顯子突變類型為D842V的鎖核酸探針如序列表中SEQ ID NO.8所示；

所述熒光探針的5’端均連接有FAM熒光基團，所述熒光探針的3’端均連接有BHQ淬滅基團，所述鎖核酸探針的3’端均連接有PO4基團。

另一方面，本發明實施例提供了一種用于檢測PDGFRA基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括：上述的引物、熒光探針和鎖核酸探針。

具體地，所述試劑盒還包括：PCR反應液、陽性質控品、陰性質控品、測序反應液、消化酶系和測序PCR產物純化試劑。

具體地，所述PCR反應液包括：含Mg²⁺的5×PCR緩沖液5μl、2.5mmol/L dNTPs 1.5μl、5U/μl Taq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA 2μl。

具體地，所述消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。

具體地，所述測序反應液包括：3μmol/L所述PDGFRA基因第12號外顯子的正向引物1μl、3μmol/L所述PDGFRA基因第18號外顯子的正向引物1μl、0.3μl 5×Bigdye和0.45μl 2.5×Buffer。

具體地，所述測序PCR產物純化試劑包括0.75mol/L NaCl和納米磁珠。

又一方面，本發明實施例提供了一種檢測PDGFRA基因突變的方法，采用上述的試劑盒，所述方法包括：

提取樣本的基因組DNA；

以獲得的所述基因組DNA作為所述模板DNA，采用所述試劑盒進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；

對所述PCR擴增產物進行純化，得到純化的PCR擴增產物；

將所述純化的PCR擴增產物作為模板，進行測序PCR擴增，得到測序PCR擴增產物；

將所述測序PCR擴增產物進行純化；

將純化后的所述測序PCR擴增產物測序分析，并與所述PDGFRA基因對應的野生型進行測序分析對比，判定所述樣本中的所述PDGFRA基因是否發生突變。