[發明專利]一種牦牛胃溶菌酶的分離方法

有效

• 申請號: 201410603940.X
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104371987A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 江明鋒;王永;鄧霄禹
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;A23K1/165;A61K38/47;A61P31/04;A61P1/12
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術領域

本發明涉及一種牦牛胃溶菌酶的分離方法。?

背景技術

溶菌酶是一種堿性蛋白質，其廣泛分布于動物、植物和微生物中，在哺乳動物的血漿、氣管、腸道、胃、腎和肝等組織細胞中均有所表達。溶菌酶通過破壞肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，導致細胞壁結構改變，從而使細菌溶解。溶菌酶由于具有抗菌性，并且無毒、副作用，可作為潛在的抗生素替代品運用于食品、生物工程、醫療和畜禽飼料等領域。從家畜疾病控制方面考慮，溶菌酶作為添加劑而使用于飼料中，可有效防治家畜腹瀉，同時為其提供營養和腸道保護，從而減少家畜的腹瀉導致的死亡，提高其出欄率。?

牦牛作為分布于高寒地區的反芻動物，是青藏高原地區最重要的家畜。由于其與內陸地區動物生存環境間的差異，造就了牦牛自身的遺傳特異性和對環境的獨特適應性。但迄今為止，未見關于分離純化牦牛胃溶菌酶的文獻報道。?

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種牦牛皺胃溶菌酶的分離純化方法。?

本發明一種牦牛胃溶菌酶的分離純化方法，包括如下步驟：?

(1)勻漿：取牦牛皺胃粘膜組織，搗碎，加入粘膜組織2倍(v/w)的醋酸銨溶液，勻漿，離心，分離上清液和沉淀，再在沉淀中再加入沉淀2倍重量(w/w)的醋酸銨溶液，離心，合并上清液，即為勻漿液；其中，醋酸銨溶液的濃度為10mM；?

(2)粗純：調節勻漿液的pH至4，離心，取上清液，在沸水浴中加熱2min，待溫度降至室溫，再調pH至5，離心，得上清，即為粗純液；?

(3)CM-Sepharose?FF柱層析：采用濃度為10mM的醋酸銨溶液平衡CM-Sepharose?FF柱，取步驟(2)的粗純液上樣，用濃度為10mM的醋酸銨洗脫雜蛋白，再用濃度為10mM～300mM的醋酸銨溶液線性梯度洗脫，根據洗脫圖譜，收集第二個峰對應的溶液，即為層析液；?

(4)Sephadex?G-75柱層析：采用濃度為0.2％(v/v)醋酸溶液平衡Sephadex?G-75柱，取步驟(3)的層析液上樣，用濃度為0.2％(v/v)的醋酸溶液洗脫，根據洗脫圖譜，收集最后一個峰對應的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液；?

(5)凍干，即得牦牛胃溶菌酶。?

步驟(1)和步驟(2)中，所述離心采用的離心力為27000g，離心時間為15min。?

步驟(2)中，第一次調pH采用冰醋酸，第二次調pH采用氨水。?

步驟(3)中，洗脫的速率為1ml/min。?

步驟(3)中，所述線性梯度洗脫時，洗脫液的總體積為20CV。?

CV，表示柱體積。?

步驟(4)中，洗脫的速率為0.2ml/min。?

步驟(4)中，先在層析柱上滴加1ml濃度為0.2％的醋酸溶液，再洗脫。?

本發明還提供了前述方法制備的牦牛胃溶菌酶，及其在制備飼料添加劑或抗菌藥物中的用途。?

采用本發明方法可以從牦牛胃黏膜組織中分離得到純品牦牛皺胃溶菌酶，其酶活高達29,268U/mg，在較寬的pH范圍和離子強度范圍內均有活性，有較好的熱穩定性能，對胃蛋白酶有抗性，應用范圍廣，具有商業應用價值，還具有抑菌作用，可以作為抗菌藥物使用，還可以作為添加劑而用于飼料中，防治家畜腹瀉。同時，本發明方法得率高，操作簡便，工業應用前景良好。?

附圖說明

圖1牦牛胃溶菌酶CM-Sepharose?FF離子交換層析；?

圖2牦牛胃溶菌酶Sephadex?G-75凝膠過濾；?

圖3純化產物SDS-PAGE電泳圖；?

圖4純化產物抑菌效果；?

圖5pH對牦牛胃溶菌酶活性的影響；?

圖6離子強度對酶活性的影響；?

圖7離子強度和pH對酶活性的影響；?

圖8溫度對酶活性的影響；?

圖9牦牛胃溶菌酶活性隨時間的變化。?

具體實施方式

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。?

實驗材料和試劑：?

實驗材料?