[發明專利]一種基于mmLDL上調腦基底動脈的ETB受體的方法

在審

• 申請號: 201410601564.0
• 申請日: 2014-11-02
• 公開（公告）號: CN104388547A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 李潔;林杰;王俊杰;曹永孝;陳碧
• 申請（專利權）人: 李潔;林杰;王俊杰
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;G01N33/68;G01N33/483
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技術領域

本發明涉及生物化學領域，特別涉及一種基于mmLDL上調腦基底動脈的ETB受體的方法。

背景技術

弱氧化低密度脂蛋白(Minimally?modified?low?density?lipoprotein，mmLDL)是腦血管疾病的危險因子。氧化型低密度脂蛋白(Fully?oxidized?LDL，oxLDL)是mmLDL進一步氧化的產物。mmLDL和oxLDL誘導細胞分裂和增殖，導致細胞死亡，促進炎癥分子和生長因子的表達。mmLDL可以和細胞膜上的LDL受體結合。有研究顯示mmLDL發揮生物效應與激活受體介導的信號轉導途徑有關。

腦血管內皮分泌內皮素-1(endothelin-1，ET-1)通過激活內皮素A(endothelin?type?A，ET_A)受體和內皮素B(endothelin?type?B，ET_B)受體介導腦血管收縮和增殖。內皮細胞上ET_B受體介導舒張功能。ET_B受體可塑性強，在試驗性腦缺血動物模型，動脈粥樣硬化病變部位，充血性心衰動物模型，蛛網膜下腔出血動物模型，在器官培養血管發現激活轉錄，使血管平滑肌上出現了介導血管收縮的ET_B受體。

蛋白激酶C(protein?kinase?C，PKC)家族是包含絲氨酸/蘇氨酸的激酶，參與激素、神經遞質及生長因子刺激誘發的信號轉導。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated?protein?kinase，MAPK)家族是另一類含有絲氨酸/蘇氨酸的激酶的家族，在平滑肌細胞信號瀑布級聯傳導時，位于PKC的下游。MAPK分為3型，ERK1/2(extracellular?signal?related?kinases?1?and?2，ERK1/2)型，JNK(C-jun?terminal?kinase，JNK)型，及p38?MAPK。MAPK將細胞外信號傳達入細胞內，是細胞內信號轉導途徑。核轉錄因子-κB(Transcription?factor?nuclear?factor-kappaB，NF-κB)是下游的轉錄因子參與炎癥介質的調節和表達。

對腦血管環的器官培養是一種體外模型，實驗證明器官培養能很好模擬腦血管疾病時G-蛋白偶聯受體的變化，并且器官培養方法利于進一步研究受體改變的分子機制。現有技術中對于mmLDL對腦基底動脈ET_B受體的影響機制尚不清晰，因此，急需一種實驗方法，來研究mmLDL是否改變ET_B受體介導的收縮功能及受體表達，同時觀察涉及的細胞內信號轉導分子機制。

發明內容

為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種基于mmLDL上調腦基底動脈的ETB受體的方法。

為達到上述目的，本發明的技術方案為：

一種基于mmLDL上調腦基底動脈的ETB受體的方法。其具體步驟為：

步驟一、動脈環的制備及器官培養

SD大鼠用CO₂麻醉，斷頭處死，迅速取出大腦放入冷的碳酸氫鹽緩沖液，取出腦基底動脈，顯微鏡下剝離血管周圍組織，血管內插入一根細線機械旋轉去除內皮，將處理好的血管切成1mm長的圓環，當乙酰膽堿引起的舒張率＜10％，認為內皮已被去除，

血管環在24孔板進行器官培養，每孔2個血管環，每孔加入含100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素的培養液培養24h，在37℃，含5％CO₂和95％O₂的培養箱內培養，由于器官培養本身可以在腦基底動脈誘發ET_B受體上調，在考察mmLDL對ET_B受體的作用時將器官培養組設為一個對照組，LDL組為另一個對照組，預實驗腦基底動脈環分別與5，10和20μg/mL的mmLDL共培養，培養時間分別為6，12，24和48h，預實驗顯示1μL的DMSO加入1mL的DMEM不影響實驗結果，為了考察mmLDL對ET_B受體的作應機制，使用了信號轉導通路的特異性拮抗劑，