[發明專利]一株高產纖維素酶的里氏木霉及其應用

有效

• 申請號: 201410597983.1
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104328056A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 黃亦鈞;吳佳鵬;許麗紅;李瑞;王玉明
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;濰坊康地恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于微生物篩選技術領域，具體涉及一種高產纖維素酶的里氏木霉及其在纖維素酶生產中的應用。

背景技術

里氏木霉(Trichoderma?reesei)是一種絲狀真菌，屬于多細胞的真核微生物，是紅褐肉座菌(Hypocrea?jecorina)的無性型，分類上隸屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、木霉屬。里氏木霉廣泛分布于自然界，在腐木、種籽、植物殘體、有機肥、土壤和甚至是空氣中(Montenecourt&Eveleigh,1979,Adv?Chem?Ser.)。

里氏木霉能表達多種胞外纖維素酶和半纖維素酶，包括外切纖維素酶(CBH1和CBH2)、內切纖維素酶(EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等)、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等。通過這些纖維素酶和半纖維素酶的協同作用，將纖維素徹底分解為單糖(Biely&Tenkanen.1998,In?Trichoderma?and?Gliocladium)，因此，木霉產纖維素酶已經是二代纖維素生物乙醇的主要酶制劑來源。

但是，木霉纖維素酶和半纖維素酶往往是協同表達的，而影響木霉纖維素酶表達的因素很多。首先，培養碳源的影響：纖維素，乳糖和槐糖用來誘導木霉產纖維素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纖維素酶的表達。碳源的誘導作用是調控因子來影響表達的，如與誘導表達相關的正調控因子是ACEII和XYR1，而負調控因子是CRE1和ACEI(Ilme′n?et?al.,1997,Mol.Gen.Genet.；Foreman?et?al.,2003,J.Biol.Chem.)。其次，菌體(菌絲)形態也是影響分泌表達的關鍵因素之一。一般認為，絲狀真菌是通過頂端分泌來輸出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形態上往往是多分枝的。

然而從自然界中直接篩選到的木霉菌株產酶水平往往很低，不適合商業生產。因此，如何通過現有技術改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生產成本就成為本領域的研究熱點之一。

發明內容

本發明的目的是提供一株高產纖維素酶的里氏木霉菌株及其應用，通過紫外誘變的方法獲得了一株菌落形態小且高產纖維素酶的里氏木霉突變株，可廣泛應用于纖維素酶的生產，降低生產成本。

本發明一方面提供了一株里氏木霉(Trichoderma?reesei)突變菌株VLKDN-1，已于2014年10月22日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO：M?2014506。

本發明還提供了上述里氏木霉突變菌株VLKDN-1在纖維素酶生產中的應用。

本發明利用紫外誘變技術，并結合搖瓶篩選獲得一株高產纖維素酶的里氏木霉突變菌株。與出發菌相比，突變菌里氏木霉VLKDN-1的發酵上清液酶活提高了235％，蛋白含量提高了157％；該突變菌的菌落形態明顯小于出發菌，且菌絲比出發菌的菌絲短、分枝多。在生產過程中，該突變菌株“小型化”的菌落形態以及菌絲短、分枝多的特點能使發酵菌液的粘度顯著降低，達到降低攪拌速度又提高溶氧的目的，從而有利于降低生產成本，應用前景廣泛。

附圖說明

圖1：出發菌和突變菌的菌落形態比較，其中：A為出發菌，B為突變菌里氏木霉VLKDN-1；

圖2：出發菌和突變菌的菌絲形態比較，其中：A為出發菌，B為突變菌里氏木霉VLKDN-1。

具體實施方式

下面結合具體的實施方案對本發明進行更詳細的描述。但本發明并不受所述實施例的限制。提供實施方案的目的是為了使說明書全面而透徹，并向本領域的技術人員全面傳達發明的范圍。除另定義外，本發明所使用的所有技術和科學術語均具有作為本發明所屬技術領域中普通技術人員通常理解的同樣的含義。

實施例1菌落“小型化”突變菌株的篩選

1、菌種處理：

將出發菌種里氏木霉(該菌株是本專利發明人黃亦鈞于2013年6月從青島市嶗山區林場的枯樹皮中篩選到的)接種于PDA瓊脂平板(馬鈴薯200-300克，葡萄糖20克，瓊脂15-20克，自來水1000毫升，自然pH)上，28-30℃恒溫培養1周至穩定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml無菌水洗刷孢子，吸取孢子懸液并計數，依據孢子含量用調整其濃度至10^5-6個/ml，然后進行后續誘變處理。

2、誘變篩選：