[發(fā)明專利]偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410597902.8
• 申請(qǐng)日: 2014-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104360073A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊昕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京愛(ài)思唯志生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 栗仲平

1.?一種偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，該診斷試紙條的結(jié)構(gòu)是，在結(jié)合墊與吸收墊之間設(shè)有NC膜，該NC膜為滴入待檢測(cè)的血樣的區(qū)域，其特征在于，在所述的NC膜中，含有免疫磁珠；該免疫磁珠是指，由聚苯乙烯包裹的鐵納米顆粒，其表面有羧基，并在活化緩沖液中與單克隆抗體偶聯(lián)后構(gòu)成的偶聯(lián)了抗體的免疫磁珠。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述混合緩沖液的組成是：2%BSA?+?1%吐溫?+?2.5％蔗糖?+?0.3%?PVP-K30，溶于10mM?pH7.4磷酸緩沖液中。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述被偶聯(lián)的抗體，是16A11和/或810；所述偶聯(lián)了抗體的免疫磁珠與待檢測(cè)的血樣的比例是：16A11磁抗4-5μl，和/或810磁抗4-5μl，待測(cè)血樣2.5-3.5μl，混合緩沖液142-152μl。

4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述偶聯(lián)了抗體的免疫磁珠與待檢測(cè)的血樣的比例是：16A11磁抗4.6μl，和/或810磁抗4.6μl，待測(cè)血樣3μl，混合緩沖液138μl。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述免疫磁珠是的直徑為200nm；所述免疫磁珠的濃度為4mg/ml,其中抗體在磁珠上的濃度不低于10μg/mg,混合緩沖液濃度不高于0.1M。

6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述的診斷試紙條中，NC膜孔徑選擇范圍為：millipore?N135,??Sartorius?N95；所述吸水墊厚度選擇范圍：GE?Whatman?CF6，或捷寧H1。

7.?根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述的試紙條，其吸收墊、結(jié)合墊與NC膜之間的連接縫隙控制在2mm，T線位置位于距離結(jié)合墊42.3mm處。

8.?根據(jù)權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，其特征在于，所述的偶聯(lián)免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，是指按照以下方法制備得到診斷試紙條：

步驟⑴-步驟⑺為試紙條制作：

⑴.試紙條在32℃過(guò)夜干燥；

⑵.將NC膜從冰箱取出，剪取適當(dāng)長(zhǎng)度置室溫平衡至少2h；

⑶.配所需濃度的抗體，2mg/ml的19C7；?方法：19C7抗體用buffer稀釋；

⑷.將NC膜貼到底板上；

⑸.劃線之前先用稀NaOH清洗一個(gè)循環(huán)后靜置，再用稀HCl清洗一個(gè)循環(huán)，靜置后用純水清洗一個(gè)循環(huán)；劃線機(jī)配置：1.5μl/cm，用鉛筆將劃好的T線標(biāo)記好；??

⑹.?32~37℃干燥過(guò)夜；

⑺.干燥結(jié)束，貼樣品墊、吸水墊、AR膜，隨后切條裝盒備用；

步驟⑻-步驟⑼.為磁珠包被方法：

⑻.活化：

以0.01M?2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液作為活化緩沖液，取10μl表面有羧基的磁珠（固體含量10%，Millipore公司提供）加入離心管中，MSE?buffer洗滌，用磁分離器分離后，棄上清液；洗滌3遍后，在離心管中加入242.5μl?MES?buffer，再加入新鮮配制的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液2.5μl和0.25g/ml?N-羥基琥珀酰亞胺溶液（NHS溶液）5μl，振蕩混勻，室溫下旋轉(zhuǎn)活化磁珠表面的羧基，反應(yīng)結(jié)束后，用MSE?buffer洗滌去除反應(yīng)的活化劑，再用MSE?buffer洗滌磁珠；

⑼.偶聯(lián)：

以0.02M?BST?buffer?作為偶聯(lián)過(guò)程的緩沖液；用250μl的BST?buffer洗滌磁珠；洗滌完成后，加入適量的單克隆抗體16A11/810，再加入BST?buffer，保持離心管內(nèi)溶液體積為250μl；振蕩混勻，使磁珠表面活化的羧基與抗體的氨基在室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)；偶聯(lián)完成后，磁分離器分離收集上清液，備用于檢測(cè)偶聯(lián)效率；

步驟⑽-步驟⑾為封閉方法：

⑽.上清液吸取后，在離心管中加入242.5μl的BST?緩沖液和甘氨酸溶液，旋轉(zhuǎn)封閉；

⑾.磁分離器分離棄上清液后，加入250μl的1%（W/V）BSA封閉液（BST緩沖液稀釋），對(duì)免疫磁珠表面沒(méi)有完全反應(yīng)的活化基團(tuán)進(jìn)行封閉；

⑿.保存：

BST?buffer洗滌封閉完成的磁珠，最后將免疫磁珠保存重懸在250μl的免疫微球保存液中。