[發明專利]一種α?葡萄糖苷酶及其應用

有效

• 申請號: 201410597020.1
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104328096B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 王華明;徐娟;黃亦鈞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N1/15;C12P19/14;C12P19/12;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種α-葡萄糖苷酶及其應用。

背景技術

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，簡稱AGLU酶，EC 3.2.1.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以從低聚糖類底物的非還原末端切開α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖；或將游離出的葡萄糖殘基轉移到另一糖類底物上形成α-1,6糖苷鍵，從而形成具有非發酵性的功能性低聚糖——低聚異麥芽糖(簡稱IMOs，主要包括異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖等)。工業上α-葡萄糖苷酶主要應用于低聚異麥芽糖的大量生產。低聚異麥芽糖是一類含有至少一個α-(1,6)糖苷鍵的低聚糖，主要是異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖，天然少量存在于醬油，蜂蜜中，它己經慢慢被用來替代傳統的蔗糖作為食品添加劑。它被攝入人體后不會被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被腸道的益生菌如雙歧桿菌作為碳源利用，故其具有良好的雙歧因子作用，可以改善人體腸道的功能。此外，由于低聚異麥芽糖的甜度只有普通糖的一半，可以有效防止兒童齲齒，適宜糖尿病人食用，可以作為飲料糖果和保健品的添加劑。在飼料工業中，低聚異麥芽糖被認為可以在提高家禽存活率的同時，又不會存在合成飼料帶來對人體的副作用，據報道，日本50％左右的飼料中都含有低聚異麥芽糖。目前，低聚異麥芽糖已經在食品、醫藥和飼料加工行業有了很廣泛的應用。

生產AGLU酶的微生物種類有細菌、曲霉、古細菌等。現在工業上生產環糊精所使用的AGLU酶主要來自黑曲霉。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生產能力普遍較低，為了克服野生菌株的低生產能力，國內外研究者通過構建基因工程菌生產重組AGLU酶。在國內，對α-葡萄糖苷酶的研究還主要在α-葡萄糖苷酶的生產菌種選育和酶學性質方面，雖然有通過RT-PCR方法擴增得到A.nigerα-葡萄糖苷酶cDNA，構建重組質粒并嘗試在大腸桿菌中表達，但酶表達量偏低，而且重組蛋白是胞內酶，分離純化的成本相對高。

迄今為止，國內生產低聚異麥芽糖用α-葡萄糖苷酶主要依賴日本進口，為了降低低聚異麥芽糖的商業成本，首先必須降低α-葡萄糖苷酶的生產成本。因此，進一步篩選出性能優良的α-葡萄糖苷酶基因并實現其在宿主菌中的高效表達成為當前研究的熱點。

發明內容

本發明為解決現有技術問題，提供了一種新型α-葡萄糖苷酶及其應用。本發明通過將來源于黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的α-葡萄糖苷酶基因轉化入黑曲霉(Aspergillus niger)中，構建得到重組工程菌株，實現了該酶在體外的高效表達，為其商業化應用奠定了基礎。

本發明一方面提供了一種α-葡萄糖苷酶，其特征在于：

1)其氨基酸序列為SEQ ID NO：1的α-葡萄糖苷酶；

2)在1)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有1)中α-葡萄糖苷酶活性的酶。

本發明另一方面提供了編碼上述α-葡萄糖苷酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

本發明提供了一種表達載體，其包含上述編碼α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。

本發明還提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述α-葡萄糖苷酶基因的表達載體。

上述表達宿主細胞為黑曲霉(Aspergillus niger)。

本發明提供了一種新型α-葡萄糖苷酶，并構建得到了表達該酶的黑曲霉重組菌株。本發明的α-葡萄糖苷酶的最適作用溫度為60℃，且在50-65℃范圍內能保持80％以上的酶活力；最適作用pH為4.5，且在pH3.0-6.0范圍內能保持80％以上的酶活力。該α-葡萄糖苷酶能高效轉化麥芽糖，轉化產物中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖的含量最高，分別達到44.1％、23.0％和21.2％，三糖總含量為88.3％。因此，本發明所述α-葡萄糖苷酶可廣泛應用于低聚異麥芽糖漿的生產，市場前景廣闊。

附圖說明

圖1：本發明構建的pGm-aglu重組表達載體質粒圖譜。

圖2：黑曲霉aglu發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中M所示為蛋白標準分子量標記，由上至下為116.0kD，66.2kD，45.0kD，35.0kD，25.0kD；泳道1所示為宿主菌黑曲霉G1分泌蛋白表達情況；泳道2、3、4所示為重組菌株黑曲霉aglu分泌蛋白表達情況，箭頭所指90kDa處為本發明所述來源于的黑葡萄穗霉的α-葡萄糖苷酶。