[發明專利]結核分枝桿菌特異性CD8+T細胞表位肽P16及其應用

在審

• 申請號: 201410596731.7
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104356198A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 馬驪;劉蘇東;羅微
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;A61K39/04;A61P31/06;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，特別涉及結核分枝桿菌特異性CD8⁺T細胞表位肽及其應用。?

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌感染后誘發、全球感染率最高的傳染病，病死率僅次于艾滋病。僅2012年，全球新發結核病患者達860萬，死亡130萬。結核病疫情的新特點在于：耐藥結核病例出現并呈蔓延之勢；結核與艾滋病共感染情況愈演愈烈。針對這兩類患者，目前并無有效的防治措施。中國是世界上結核病負擔最重的國家之一，研發適合中國人群的結核病疫苗和治療藥物已時不我待。?

結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis，MTB)是胞內寄生菌，對其有效控制主要依賴于細胞免疫，尤其是T細胞免疫。人體內T細胞主要分為CD4⁺T(Th)細胞和CD8⁺T(CTL)細胞兩大亞群，大量研究已經證明，這兩種T細胞亞群對于控制結核菌感染都具有重要作用，其中CD8⁺CTL更是清除結核菌的主力軍。?

T細胞無法識別完整的結核菌和蛋白抗原，而是識別經過抗原遞呈細胞攝取和加工后釋放出的結核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫應答的核心部份，也稱為抗原決定簇，它與抗原遞呈細胞表面的HLA分子結合形成肽-HLA復合物并被遞送和表達在抗原遞呈細胞表面，進而活化T細胞，誘發T細胞免疫反應。CD4⁺T細胞識別HLAII類分子遞呈的表位肽，而CD8⁺T細胞識別HLAI類分子遞呈的表位肽。T細胞對表位肽的識別及其活化要求表位肽與抗原遞呈細胞表面HLA分子穩定結合，而肽與HLA分子的親和力是形成肽-HLA復合物的關鍵，因此制備誘發T細胞免疫的治療藥物和疫苗，首要步驟是篩選出高親和力的肽，進而鑒定出具有免疫活性的表位肽。?

表位肽可以完全通過人工合成獲得，研發周期短；由于剔除了表位肽以外病原體其他有害成分，安全性良好；還可以將多個表位肽串聯使用，加強免疫效果和減少免疫逃逸。目前已知的結核菌CTL表位肽主要是在歐美人群中鑒定，多為HLA-A*0201限制性，而對于結核病流行最嚴重的非洲和東南亞人群，并沒有合適的表位肽可使用。在中國，HLA-A*1101是?人群中基因頻率最高的HLA分子，鑒定HLA-A*1101限制性CTL表位對于研發適合中國人群的表位肽疫苗具有非常重要的意義。?

發明內容

本發明的目的在于提供結核分枝桿菌特異性CD8⁺T細胞表位肽。?

本發明的另一目的在于提供該結核分枝桿菌特異性CD8⁺T細胞表位肽在制備結核病疫苗、診斷試劑和治療藥物中的應用。?

本發明所采取的技術方案是：?

本發明提供了與HLA-A*1101分子親和力高，能活化CD8⁺T細胞、誘導其增殖和分泌IFN-γ的結核分枝桿菌特異性CD8⁺T細胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列為：TTSNVSVAK(SEQ?ID?NO.16)(即：Thr-Thr-Ser-Asn-Val-Ser-Val-Ala-Lys)。?

本發明結合生物信息學預測方法和紫外誘導肽置換實驗，利用結核分枝桿菌自身的抗原篩選出具有抗結核活性的表位肽，高效準確地檢測出表位肽TTSNVSVAK(SEQ?ID?NO.16)與HLA-A*1101分子之間的親和力。這是新的、未被報道過的HLA-A*1101限制性結核分枝桿菌表位肽，被結核病人CD8⁺T細胞廣泛識別。由于HLA-A*1101基因型是中國人中最廣泛攜帶的基因型，目前并未發現結核分枝桿菌特異的HLA-A*1101限制性CTL表位肽，本發明表位肽的確定，為結核病疫苗、診斷試劑和治療藥物的研發提供了理論基礎和新的解決方案，對結核病的防治具有重大意義。?

附圖說明

圖1為候選表位肽與HLA-A*1101分子親和力示意圖。?

圖2為22條高親和力的表位肽誘導結核患者T細胞活化并分泌IFN-γ的示意圖。?

圖3為ELISPOT檢測P16誘導結核患者T細胞分泌IFN-γ的示意圖。?

圖4為P16的質譜分析圖。?

圖5為CFSE標記的淋巴細胞增殖實驗檢測P16誘導結核患者CD8+T細胞增殖的結果示意圖。?

具體實施方式