[發明專利]偶聯免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條的制備方法

有效

• 申請號: 201410596438.0
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104483477A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 楊昕
• 申請（專利權）人: 南京愛思唯志生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/68
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 栗仲平

技術領域

本發明涉及一種制備方法，具體涉及一種偶聯免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條的制備方法。

背景技術

肌鈣蛋白是一種調節心肌收縮的蛋白質分子，由肌鈣蛋白C（TnC）、肌鈣蛋白T（TnT）和肌鈣蛋白I（TnI）三個亞基組成。隨著心臟生物標志物應用的不斷發展，肌鈣蛋白已成為診斷心肌梗死（MI）的首選標志物。該標志物的臨床快檢（POCT）的發展，能夠讓患者得到及時適當的治療。以羅氏的肌鈣蛋白T測試卡為例，cTnT的臨界值為0.1ng/ml，檢測卡的檢測范圍為0.1-2ng/ml，檢測時間為8-12分鐘。

目前用于POCT診斷cTnT和cTnI的免疫學方法主要包括了膠體金免疫層析法和熒光法。這兩種方法都能夠應用于診斷試紙條。

膠體金免疫層析法制備的膠體金診斷試紙條，其檢測結果可通過肉眼觀察到顯色現象。但肌鈣蛋白的濃度無法通過顏色變化準確定量。此外，金納米與抗體的連接通常采用被動吸附法，該反應雖然簡單快速，但無法控制抗體的Fab端在納米顆粒表面的方向性，降低了抗原捕獲效率，對抗體原料的利用率也有一定的影響。

熒光法與膠體金免疫層析法類似，相對于金納米顆粒而言，熒光微球在診斷試紙條上流動時，由于微球尺寸較大（200nm及以上），容易產生團聚；流動過程中，微球-抗體連接物在未到達T線時已經發生了部分的沉積，造成較強的非特異性吸附；在檢測時，由于光學檢測器只能收集試紙條表面的光強信號，對血樣全部流過T線后的情況無法完全反映，使得檢測結果不精準。

半導體量子點雖然光穩定性好、發射譜帶較窄、量子產率較高、發光可調，但其潛在的生物毒性及間歇發光性（光閃爍）限制了在生物檢測領域的應用。

稀土上轉換發光材料的晶體高晶化程度對材料的發光能力影響顯著。但提高高晶化程度會大大增加合成材料的工序和成本。配套的光學檢測器對激發光的波長范圍要求很高，而常規激發光的發射功率又偏低，導致了包括發光材料和檢測器在內的整套檢測產品的制造成本偏高，限制了該類材料的大規模生產與普及應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種改進的、偶聯免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條的制備方法。本方法中提供了新的磁珠包被方法：特別是包括活化步驟與偶聯步驟：以2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液（MES?buffer）作為活化緩沖液，對表面有羧基的磁珠進行活化；以硼酸-吐溫作為緩沖液（BST?buffer），將活化后的磁珠與單克隆抗體16A11/810進行偶聯。本發明的制備方法操作簡單，結果可靠。新方法所制備的診斷試紙條克服了現有技術的不足，能夠簡單快速地檢測肌鈣蛋白，檢測結果更加精準，應用領域較寬，對抗體原料的利用率較高。

本發明的方法所制備的偶聯免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條，與現有技術有所區別，該診斷試紙條的結構是，在結合墊與吸收墊之間設有NC膜（硝酸纖維膜），該NC膜為滴入待檢測的血樣的區域，其特征在于，在所述的NC膜中，含有免疫磁珠；該免疫磁珠是指：直徑約200nm的由聚苯乙烯包裹的鐵納米顆粒，表面有羧基，并在活化緩沖液中與單克隆抗體偶聯后構成的偶聯了抗體的免疫磁珠。

偶聯了抗體的免疫磁珠，可以簡稱為“磁抗”，?其中，所述被偶聯的抗體，可以是16A11和/或810。根據偶聯抗體的不同，可以分別稱為：16A11磁抗或810磁抗。

完成本申請發明任務的技術方案是，一種偶聯免疫磁珠的肌鈣蛋白診斷試紙條的制備方法，其特征在于，步驟如下：

步驟⑴-步驟⑺為試紙條制作：

⑴.試紙條在32℃過夜干燥；

⑵.將NC膜從冰箱取出，剪取適當長度置室溫平衡至少2h；

⑶.配所需濃度的抗體，2mg/ml的19C7；?方法：19C7抗體用buffer稀釋；

⑷.將NC膜貼到底板上；

⑸.劃線之前先用稀NaOH清洗一個循環后靜置，再用稀HCl清洗一個循環，靜置后用純水清洗一個循環；劃線機配置：1.5μl/cm，用鉛筆將劃好的T線標記好；

⑹.?32~37℃干燥過夜；

⑺.干燥結束，貼樣品墊、吸水墊、AR膜，隨后切條裝盒備用；

步驟⑻-步驟⑼.為磁珠包被方法：

⑻.活化：