[發明專利]一種同一產地海產品檢測方法

有效

• 申請號: 201410596028.6
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104313165A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 鄭剛;胡富強;楊志堅;泮紅文;陳作國;蔡勇;肖金星;陳磊;李靜靜
• 申請（專利權）人: 浙江大學舟山海洋研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于海產品檢測，涉及一種同一產地海產品檢測方法。

技術背景

地理標志證明商標是國際通行的一項制度，對產地、產品提供質量證明，能提高商品對消費者的吸引力。換句話說，地理標志就意味著品質遠非其他同類產品可比。運用地理標志證明商標，既能保護當地獨有的自然資源、產品和文化遺產，也有助于當地實施品牌漁業發展戰略，提高當地漁業競爭力，大大提升當地的知名度。而在實際生活中，貼錯地理標簽的商業水產品并不少見，尤其是對那些利潤豐厚的水產品。一些不法商販常以其他地方的水產品假冒當地水產品，嚴重損害了當地水產品的商譽，破壞了當地的形象。

按照慣例，帶有地理標志證明商標的農產品價格普遍比同類產品價格高出15%～80%，甚至更多，安吉白茶、臨海蜜橘就是最好的例子。如舟山帶魚年捕撈量還有13.6萬噸；稀缺資源大黃魚去年捕撈量也比前些年有所增加；而養殖的三疣梭子蟹總面積達5萬多畝，產值達5億多元。如果應用分子條形碼技術快速識別地理標志，將保護當地漁業資源，提高當地漁業競爭力和知名度。

因此，有必要建立一種快速、準確和敏感的認證方法來保護地理標志產品。通過水產品中的一組保守基因的收集和擴增比對，給地理標志水產品打上分子條形碼從而辨別出原產地。

發明內容

本發明的目的是提供一種同一產地海產品檢測方法，具體步驟如下：

1.樣品預處理，取5條新采集來的魚類產品，各取其魚體樣品后，提取總DNA：

（1）取海產品樣品約0.01g，放入1.5mlBuffer管中用無菌小剪刀剪碎，加入400μL?SDS提取緩沖液和8μL20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55℃水浴鍋中水浴2?h或者37℃過夜，中間震蕩數次；?

（2）上清液加入300μL的6M/L?NaCl溶液，充分搖均，10000g/min?離心30?min；

（3）上清液移入新管加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混合液，搖均，10000g/min?離心10min；

（4）上清液移入新管加入等體積異丙醇，-20℃下沉淀1h以上，10000g/?min?離心10?min；

（5）棄去上清液，沉淀用70%的酒精沖洗兩次，無水乙醇洗一次；?

（6）室溫下晾干，加入50μL?TE溶液溶解。-20℃保存，備用。

2.PCR擴增、測序

利用CO1基因的通用引物：LCO1409：5一GGTCAACAAATCATAAAGATATAGG一3和LC02198：5—AAACTTCAGGGTGAC—CAAAAAATCA一3進行PCR擴增。50ul?體系PCR緩沖液:DNA模版100?ng，dNTP?0.2?umol/L，引物1?umol/L，鎂離子濃度2?umol/L，Taq?聚合酶2?umol/L，超純水補至50?uL。反應在PCR擴增儀上經94℃預變性5?min，然后進入循環；94℃變性1?min，51℃退火90?S，72℃延伸45?S，共35個循環；72℃延伸10?min。將擴增出的片段進行電泳驗證，然后測序；

3.?遺傳距離測定

將測序結果經過人工校對及拼接后，與原產地海產品CO1基因庫進行比對，得出相似度。相似度結果在99.0%以上的即為同一產地海產品。

本發明利用一組原產地海產品的?線粒體基因中的細胞色素氧化酶基因CO1序列設計特異性引物，對提取的不同的海產品進行PCR擴增，產生了不同的PCR片段的核酸序列。通過不同的基因序列與原產地海產品的CO1基因序列比較，經過生物學分析就可以確定產品的真偽。

附圖說明

圖1是實施例1電泳圖。從左到右條帶是樣品1-5，最后是marker。

圖2是實施例2電泳圖。從左到右條帶是樣品1-5，最后是marker。

具體實施方式

????本發明結合實施例作進一步的說明。

實施例1??

一、樣品預處理（DNA提取）

1、取5條帶魚樣品背部肌肉約0.01g，編號dy1，?dy2，?dy3，?dy4，?dy5，放入1.5mlBuffer管中用無菌小剪刀剪碎，加入400μL?SDS提取緩沖液和8μL?20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55℃水浴鍋中水浴2?h或者37℃過夜，中間震蕩數次。?

2、上清加入300μL的6M/L?NaCl溶液，充分搖均，10000g/min?離心30?min。

3、上清移入新管加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混合液，搖均，10000g/min?離心10min。?