[發(fā)明專利]一種靈芝多糖高產(chǎn)工程菌株Rmust-UDP及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410595875.0
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104403955A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐軍偉;李煥軍;任夢飛;紀(jì)森林;張德懷
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/80;C12R1/645
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和代謝工程領(lǐng)域的，具體涉及一種通過基因工程對靈芝代謝途徑中有關(guān)靈芝多糖合成的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP）基因過表達(dá)的方法，構(gòu)建了一個靈芝多糖的高產(chǎn)工程菌株。

背景技術(shù)

靈芝(?Ganoderma?lucidum?)?是擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌。靈芝真菌在我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應(yīng)用靈芝作為藥物已有兩千多年的歷史。靈芝對于增強人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護(hù)肝，促進(jìn)睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的藥用價值，靈芝的有效成分分析和藥理學(xué)研究已經(jīng)引起了國際上的廣泛關(guān)注，尤其在日本，美國，韓國等國家。目前，靈芝的研究已經(jīng)深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學(xué)特性、栽培技術(shù)、藥理學(xué)作用及臨床應(yīng)用等情況。

靈芝多糖是從靈芝中提取的一種新內(nèi)源活性物質(zhì)，其所含的化學(xué)成分能夠顯著提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力，增強體液免疫和細(xì)胞免疫功能，還能提高紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶活性，對人體具有多種功能。

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP）基因是靈芝多糖合成途徑中的一個較為重要的基因。在細(xì)胞中，糖原分解會產(chǎn)生大量游離的葡萄糖-1-磷酸，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶主要催化葡萄糖-1-磷酸變?yōu)閁DP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖是糖原生物合成中糖基的供體。這是糖原合成的第一步反應(yīng)。糖原合成后再經(jīng)過一系列的反應(yīng)就產(chǎn)生了各種多糖。因此UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因?qū)μ窃暮铣删哂兄匾淖饔?。靈芝多糖的合成途徑如下所示：

隨著人們生活水平的提高，各種癌癥等疾病的發(fā)生率也逐年遞增。于是，人們對健康的關(guān)注也越來越來廣泛。靈芝作為一種良好的中藥對提高人體免疫力，抗氧化，抗腫瘤，抗衰老等方面具有重要的地位。

由于野生靈芝生長周期長，受環(huán)境因素影響大且野生靈芝資源有限，靈芝菌絲培養(yǎng)成為生產(chǎn)活性物質(zhì)的重要方法。隨著對靈芝活性物質(zhì)需求的不斷增加，如何提高靈芝的產(chǎn)量和增加靈芝的有效成分越來越引起人們的關(guān)注。液體深層發(fā)酵技術(shù)是進(jìn)行快速工業(yè)化生產(chǎn)的重要手段?，F(xiàn)在市售的靈芝多糖主要是從靈芝子實體和液體深層發(fā)酵得到的菌絲體中獲得。由于野生靈芝液體深層發(fā)酵時靈芝多糖在靈芝細(xì)胞中的含量較低，分離純化也較難，限制了靈芝多糖的活性及作用機理研究及其廣泛應(yīng)用。近年來，基因工程與代謝工程迅速發(fā)展，成為了現(xiàn)代分子育種的重要手段。通過分子克隆和基因拼接等分子生物學(xué)方法來改造菌株的基因組，從而提高活性成分的含量越來越受學(xué)者們的青睞。如何從分子水平上提高靈芝多糖的產(chǎn)量是目前急需解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決野生型靈芝菌株自身產(chǎn)靈芝多糖較低的問題，提供一種靈芝多糖高產(chǎn)菌株，該菌株為高產(chǎn)靈芝多糖的靈芝（Ganoderma?lucidum）工程菌Rmust-UDP，已于2014年6月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?NO.?9324。

本發(fā)明靈芝多糖高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法如下：

以PMD19-T為起始載體并使用靈芝本身的強啟動子P-gpd、終止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因（具有carboxin抗性）是來自靈芝本身的抗性基因，其特點是在蘑菇類擔(dān)子菌的轉(zhuǎn)化體系中同源標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化效率更高，能夠穩(wěn)定遺傳，抗性強；

1、將靈芝啟動子P-gpd與終止子T-sdhB與PMD19-T連接，將靈芝cbx抗性基因插入到Pst?I酶切位點，從而構(gòu)建成pJW-EXP載體；其具有靈芝的強啟動子和終止子，并具有靈芝本身的抗性；其中擴增靈芝強啟動子P-gpd的引物序列為：

P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC-?3’?，

P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-?3’；

擴增靈芝sdhB基因終止子的引物序列為：

T-sdhB-F:?5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT-?3’，

T-sdhB-R?:?5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT-?3’；

擴增靈芝cbx抗性基因的引物為：