[發明專利]一種細胞催化生產氟吡啶乙酮的方法

在審

• 申請號: 201410594936.1
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104293856A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 劉均洪;高鑫
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/80
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到青霉菌細胞生物催化制備手性醫藥中間體(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶的技術。

背景技術

手性(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其他特殊材料的重要中間體。生物催化不對稱反應具有環境友好、條件溫和、選擇性高等優點,作為綠色高效制備羥基手性化合物的優先途徑,被越來越多地應用于生產一些高附加值的手性化合物。生物催化制備手性(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶具有很好的應用前景。

生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點,是可持續發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中,水解酶能夠催化動力學拆分外消旋體得到手性產品,在工業生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來,氧化還原酶在工業上的應用得到了迅速增長。目前,采用水解酶動力學拆分法、生物催化法和生物氧化法工業制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。生物細胞還原法相對于動力學拆分法而言,最大的優勢在于理論收率可達100%,原子經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與,一定程度上限制了其應用。由于輔酶依賴性的緣故,生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑,實現體內輔酶循環再生的同時免去了酶的分離純化步驟。

?(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手性砌塊，由于有2個手性中心，使得化學合成較為困難，成本高。本發明將采用生物催化制備(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶。

發明內容

本發明采用青霉菌細胞催化制備(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶，反應式如下：

底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮（1）經青霉菌催化反應，得到產物(S)-5-（1-羥乙基）氟[2,3-c]吡啶（2）。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用青霉菌作為催化劑，因為其催化1反應的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%）均很高。

許多青霉菌都可以進行生物催化本反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗，本發明選用青霉菌菌株為ATCC?204054，其催化本反應效果最佳。

培養介質：

1、　培養液成份：玉米漿(?以干物質計)含量為35-45g/L，?酵母浸膏8-10?g/L，葡萄糖18-22?g/L，麥芽浸膏25-30?g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣?0.7?g/L,硫酸亞鐵?0.18?g/L,硫酸錳?0.025?g/L;pH?4.7-4.9。

2、固體培養基成份：?在液體培養基中加入1.5-2%的瓊脂粉。

青霉菌細胞制備。青霉菌經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至25-26℃，將青霉菌ATCC?204054種子液接種至發酵罐，接種比例為10-15％，通氣比為0.5-1V/（V分鐘），即每分鐘通氣量為0.5-1倍發酵液體積，25-26℃培養32-40小時，用過濾式離心機離心得到濕青霉菌細胞，用作生物催化反應催化劑。濕細胞制取技術為成熟技術。

由于底物、產物均對青霉菌細胞有抑制作用，為了減少底物、產物對細胞的抑制，本發明采用苧麻紗布吸附底物，反應中，當底物被細胞催化反應，濃度降低時，底物從苧麻紗布溶出，補充反應消耗的底物。同時，產物被苧麻紗布吸附，減少了其在水中的濃度，從而大幅度降低了底物、產物對細胞的抑制。底物與苧麻紗布的比率，決定了反應液中底物、產物的濃度，而且，濃度還與反應溫度、反應液成份有關。不同細胞對底物、產物的敏感度不同，所以，要進行大量實驗，才能確定最佳的底物與苧麻紗布的比率。實驗表明，對于本發明的菌株、反應液成份、反應溫度，最佳的底物與苧麻紗布的比率為0.24-0.26。具體吸附時，將底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸為0.5cmX0.5cm的苧麻紗布吸收，即得到吸附了底物的苧麻紗布。調節底物與苧麻紗布用量，使得底物與苧麻紗布的質量比率為0.24-0.26。所用苧麻紗布為普通苧麻紗布，從市場上購買后，切成0.5cmX0.5cm小塊，滅菌，無菌保存待用。