[發(fā)明專利]一種基于甲基化環(huán)狀DNA分子的突變方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410593852.6 | 申請日： | 2014-10-30 |
| 公開（公告）號： | CN104404029A | 公開（公告）日： | 2015-03-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 蔣國成;陳旭;陳剛;佟勇 | 申請（專利權(quán)）人： | 依科賽生物科技（太倉）有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 上海卓陽知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262 | 代理人： | 馬偉 |
| 地址： | 215434 江蘇省蘇州市*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 甲基化 環(huán)狀 dna 分子 突變 方法 | ||
1.一種基于甲基化環(huán)狀DNA分子的突變方法，其特征在于，包括以下步驟：
a）PCR反應(yīng)獲得帶有特定突變的環(huán)形單鏈DNA：以甲基化環(huán)狀DNA為模板，使用帶突變位點的突變引物，采用高保真的耐熱DNA聚合酶和高溫DNA連接酶進行擴增；
b）將步驟a）的PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶Dpn?I消化，去除甲基化模板；
c）將步驟b）中的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，所述的帶有特定突變的環(huán)狀單鏈DNA修復(fù)為帶有特定突變的環(huán)狀雙鏈DNA，最終得到突變后的質(zhì)粒。
2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，步驟a）中，所述的高保真的耐熱DNA聚合酶為Phusion?High-Fidelity?DNA?Polymerase。
3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，步驟a）中，所述的高溫DNA連接酶為Taq?DNA?Ligase?連接酶或9°N?DNA?連接酶。
4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，所述的高保真的耐熱DNA聚合酶與高溫?DNA?連接酶的添加比例為：酶活力單位比1：60。
5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，所述的突變引物是以甲基化環(huán)狀DNA為模板設(shè)計的單條引物，在突變位點前后各保留16~20個與模板配對的堿基。
6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，步驟b）中，使用限制性內(nèi)切酶Dpn?I消化的時間為5分鐘至過夜。
7.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，步驟c）中，所述的消化產(chǎn)物是直接轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中。
8.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變方法，其特征在于，PCR反應(yīng)的體系中還包含反應(yīng)緩沖液、GC反應(yīng)緩沖液、dNTP、ATP、NAD+。
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