[發明專利]一種鑒別飼料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的核苷酸序列和方法

有效

• 申請號: 201410592070.0
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104313022A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 李冰玲;馬貴平;高志強;劉全國;李炎鑫;蒲靜;史喜菊
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及檢驗檢疫和生物技術領域，具體地說，涉及一種鑒別飼料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的方法。

背景技術

羊癢病是與瘋牛病密切相關的一類動物傳染病。為防止羊癢病通過相關產品的貿易傳入我國，我國頒布了貿易禁令對該病進行防控。1996年7月，我國農業部就發布了《關于嚴防癢病傳入我國的通知(農檢疫發〔1996〕7號)》，規定“禁止從上述有癢病的國家口(包括直接進口和轉口)羊、羊胚胎、羊精液、羊內臟(含腸衣)及其制品、肉骨粉、骨粉、羊脂(油)以及含有羊蛋白的動物飼料等”。

飼料和飼料添加劑生產中可能添加的來源于牛羊的原料包括：肉粉、骨粉、血液及其制品、內臟及其制品、奶及其制品。在這些可能原料中，除奶及其制品是允許在進口飼料及添加劑中存在的之外，其它成分都是不允許添加的。

目前國內外對于同一種屬不同組織成分來源的鑒別研究還比較少，主要有酶聯免疫吸附法(ELISA)、氯仿分離后PCR檢測法、水和次氯酸鈉洗滌后PCR檢測法，這些方法的使用范圍很窄，且特異性不高，因此也很少在實際中應用。目前我國對進口動物飼料和飼料添加劑的把關主要采用普通PCR方法或實時熒光PCR方法對飼料中是否含有羊源性成分進行檢測，但這類方法是對種屬來源進行鑒別，無法對成分的組織來源進行鑒別和區分，即無法區分其中添加的是允許添加的乳源性成分，還是加入了貿易禁令范圍內的組織成分。本技術建立的是一種可以對飼料中的羊源性成分進行組織來源鑒別的檢測方法，對飼料中貿易禁令范圍內和范圍外的羊源性組織成分進行鑒別，滿足進境飼料和飼料添加劑中羊癢病危險物質檢測的需要，以實現科學、有效的執法把關，同時也可用來規范我國的飼料生產，保障畜產品安全和人民生命健康。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一種用于鑒別羊肉骨粉成分的寡核苷酸。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的用于鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒。

本發明要解決的第三個技術問題是提供一種鑒別飼料中羊肉骨粉成分的方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了用于鑒別羊肉骨粉成分的組織標的物：羊骨粘連蛋白mRNA的一段117bp的核糖核酸序列(第309位-第425位)，其具有如序列表SEQ?ID?No.1所示的堿基序列。

5’-CCCCAUCGGCGAGUUUGAGAAGGUGUGCAGCAAUGACAACAAGACCUUCGACUCUUCCUGCCACUUCUUUGCCACCAAGUGCACACUGGAGGGCACCAAGAAGGGCCACAAGCUCCA-3’

其中，羊骨粘連蛋白對應的堿基序列如SEQ?ID?No.2所示。

根據上述選取的羊骨粘連蛋白的mRNA序列，本發明提供了一組用于鑒別羊肉骨粉成分的寡核苷酸，其具有SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的堿基序列，具體序列如下：

上游引物序列：5’-CCCCATCGGCGAGTTTGA-3’(SEQ?ID?No.3)

下游引物序列：5’-TGGAGCTTGTGGCCCTTC-3’(SEQ?ID?No.4)

本發明還提供了一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒，包括以下試劑：

1)RT-PCR反應液，其包括：

上游引物、下游引物、逆轉錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR?buffer；

其中，上游引物和下游引物分別是SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列；

進一步地，本發明所用的逆轉錄酶通常為商品化試劑，例如RT?Enzyme?MixⅡ，購自Takara公司；本發明所用的Taq聚合酶通常為商品化試劑，例如HS(5U/μl)，購自Takara公司；本發明所用的RT-PCR?buffer通常為商品化試劑，例如2×One?StepRT-PCR?BufferⅢ，購自Takara公司。

2)RNase?Free?dH₂O；

3)陰性對照，所述陰性對照為從羊乳中提取的總RNA；

4)陽性對照，所述陽性對照為從羊肉骨粉中提取的總RNA。

本發明還提供了一種鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒的使用方法，該方法基于羊骨粘連蛋白的mRNA片段序列，并以其作為目標片段設計特異性引物、通過實時熒光RT-PCR鑒別飼料中羊肉骨粉成分，包括以下步驟：

1)取待測樣品研磨，提取總RNA；