[發明專利]L?天冬氨酸氧化酶變體和使用所述變體生產喹啉酸或煙酸的方法

有效

• 申請號: 201410588148.1
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104450638B
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 金素影;申容旭;許仁庚;金朱恩;羅光鎬;徐昌一;孫晟光;李在熙
• 申請（專利權）人: CJ第一制糖株式會社
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/185
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 曹立莉

技術領域

本發明涉及L-天冬氨酸氧化酶變體，包括編碼所述L-天冬氨酸氧化酶變體的基因的生產喹啉酸的微生物，和使用所述微生物高效生產喹啉酸或煙酸的方法。

背景技術

煙酸是尼古丁的氧化物和復合維生素B的一員。它是一種水溶性維生素，也被稱為尼克酸，或維生素B3，并在動物和植物中普遍存在。煙酸的缺乏可能會導致糙皮病或神經病變。通常，煙酸在體內以煙酸酰胺輔酶的形式存在，即，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，并參與氧化還原反應。

喹啉酸(quinolinate)，其也被稱為喹啉酸(quinolinic acid)，其由喹啉的氧化產生。喹啉酸已知具有神經毒性并導致多種神經障礙。喹啉酸也被認為是煙酸的前體。

廣泛地適用于食品和藥品的煙酸可以通過化學合成法或生物學生產方法制備。化學合成煙酸可能導致包括催化劑在內的大量有毒廢料。因此，該廢料需要徹底的管理和高額費用進行處理。此外，作為前體的嘧啶具有多種衍生物，且嘧啶的供應和價格波動導致煙酸不穩定的價格。

為了從化學合成方法解決這些問題，研究了通過使用來源于可再生的碳水化合物的材料生產煙酸的生物方法。主要通過兩種生物合成途徑完成煙酸的生物學生產，其中之一是由色氨酸作為真核生物起始原料開始的煙酸生物合成途徑，另一種是由天冬氨酸作為原核生物起始原料開始的。兩種途徑都使用喹啉酸作為中間體，且通過喹啉酸磷酸核糖基轉移酶(nadC)、煙酸-單核苷酸腺苷轉移酶(nadD)、NAD合成酶(nadE)、煙酰胺-核苷酸腺苷轉移酶(NMN nadR)和煙酰胺酶(pncA)的作用，從喹啉酸生物合成煙酸。

經由天冬氨酸的途徑使用重組大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌的煙酸的生物合成的方法已經公開(韓國專利號10-1223904)。本發明的發明人研究了從煙酸的這些生物合成方法解決問題并改善喹啉酸或煙酸的產率，發現了涉及喹啉酸的高產率生產的酶變體，并完成了本發明。

發明詳述

技術問題

本發明提供了L-天冬氨酸氧化酶的變體，其顯示出由煙酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)導致的反饋調節被解除。

本發明提供了生產喹啉酸的微生物，所述微生物包含L-天冬氨酸氧化酶的變體。

本發明提供了通過培養微生物生產喹啉酸的方法。

本發明提供了通過培養微生物和喹啉酸的脫羧生產煙酸的方法。

技術方案

本發明的一個方面提供了L-天冬氨酸氧化酶的變體，其具有在SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。

L-天冬氨酸氧化酶具有將L-天冬氨酸氧化成亞氨基琥珀酸的催化活性，如反應式1所示。

<反應式1>

L-天冬氨酸+富馬酸<＝>α-亞氨基琥珀酸+琥珀酸+H⁺

L-天冬氨酸+氧<＝>過氧化氫+α-亞氨基琥珀酸+H⁺

本發明的L-天冬氨酸氧化酶可包括表示為SEQ ID NO：1的氨基酸序列。然而，它并不限于此，因為取決于微生物物種或菌株，蛋白質的氨基酸序列可能存在差異。換言之，它可以是突變體蛋白或人工變體，該突變體蛋白或人工變體具有在由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的一個或多個位置包含一個或多個氨基酸的取代、刪除、插入或添加的氨基酸序列，只要它可以將L-天冬氨酸氧化成亞氨基琥珀酸。本文中，"多個″可依據蛋白質的氨基酸殘基的三維結構中的位置或類型而有所不同，但具體地是指2至20，特別是2至10，且更具體地2至5。此外，若基于在個體或微生物的種類的差異，氨基酸的取代、刪除、插入、添加或反轉包括由人工變體或天然突變引發的那些。

編碼本發明的氨基酸序列的多核苷酸可包含編碼具有表示為SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或與其同源性為80％或更多的氨基酸序列、特別是90％或更多的氨基酸序列、更具體地95％或更多的氨基酸序列、特別具體地97％或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有與L-天冬氨酸氧化酶類似的活性。最具體地，它可以是由SEQ ID NO：24所表示的多核苷酸序列。

術語“同源性”是指兩個氨基酸序列之間的同一性，且其可由本領域技術人員熟知的方法確定，用BLAST2.0來計算參數，例如得分、同一性和相似性。