[發明專利]一種用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201410587531.5
• 申請日: 2014-10-20
• 公開（公告）號: CN105506068A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 張道允;鞏子英;張恒;羅堅誠;賈寧
• 申請（專利權）人: 江蘇所羅門兄弟醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒，其特征在于： 包括qPCR反應體系，所述qPCR反應體系包括qPCR混合反應液、參照引物、 ARMS引物和陽極對照樣品；所述qPCR混合反應液包括PCR緩沖液、dNTP、 MgCl₂、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探針；

所述qPCR反應體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為1X；dNTP 為0.1～1.5mM；MgCl₂為0.5～5mM；Tag酶為0.05～0.1U/μl；PCR下游引物為0.1～1 μM；TaqMan探針為0.1～1μM；參照引物為0.5μM；ARMS引物為0.5μM；陽 性對照樣品為1～10ng/μl。

所述PCR下游引物的序列如MMP2-R所示；

所述TaqMan探針的序列如MMP2-TaqMan所示；

所述參照引物的序列如MMP2-C所示，能夠擴增所有不同MMP2基因型；

所述ARMS引物為兩種上游引物中的任意一種，分別對應MMP2CC rs1132896、TTrs1132896型基因型，這兩種上游引物的序列如MMP2-F1、 MMP2-F2所示；這兩種ARMS引物分別在3’末端與不同的基因型堿基匹配， 同時在其3’末端倒數第2、3位增加一個或者兩個堿基錯配，用于特異性擴增 的MMP2rs1132896位基因型為CC/TT/TC；

所述陽極對照樣品分別為MMP2不同基因型堿基置換的質粒基因組DNA。

2.根據權利要求1所述的用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑 盒，其特征在于：所述Tag酶為TakaraTag酶或GoldstarBestTag酶。

3.基于權利要求1或2所述試劑盒的MMP2基因分型ARMS-qPCR檢測 方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)設計并篩選含有MMP2基因rs1132896位不同基因型通用的參照引物、 TaqMan探針及兩種ARMS引物；

(2)從細胞體系或血液中提取到基因組DNA作為模板DNA；

(3)進行實時熒光定量PCR擴增，每個樣本的檢測分3管進行，每個管加入 相同的qPCR混合反應液，TaqMan探針和模板DNA，每管分別加入參照引物 和兩種ARMS引物中的一種，進行MMP2基因rs1132896位基因分型的qPCR 檢測；

(4)結果判讀：

參照引物管擴增曲線陽性，MMP2-F1管擴增曲線陽性，MMP2-F2管擴增 曲線陰性或者其與參照引物管的擴增曲線ΔCT＞10，該樣本結果判定為 rs1132896CC基因型；

參照引物管擴增曲線陽性，MMP2-F1管擴增曲線陽性，MMP2-F2管擴增 曲線陽性，該樣本結果判定為rs1132896C/T基因型；

參照引物管擴增曲線陽性，MMP2-F1管擴增曲線陰性或者其與參照引物管 的擴增曲線ΔCT＞10，MMP2-F2管擴增曲線陽性，該樣本結果判定為rs1132896 TT基因型；

參照引物管擴增曲線陰性，提示該樣本提取失敗，需要重新進行提取。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中，模板 DNA選自人體血液基因組DNA或者口腔黏膜脫落細胞或頭發。

5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中，進行 PCR擴增反應的條件為，95℃預變性2min，95℃變性15s，60℃延伸1min，46 個循環。