[發明專利]一種分離培養腫瘤細胞的消化液

在審

• 申請號: 201410586787.4
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104371975A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 李斌;陳道梅;王家強
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及動物細胞培養分離技術領域，尤其涉及一種用于分離腫瘤細胞的消化液。??

背景技術

在對腫瘤細胞生物學特性進行分析研究時，首先需將樣品制備成分散的單細胞懸液。分離培養腫瘤細胞的傳統方法是：用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化細胞10分鐘左右，消化結束后加入含血清或蛋白酶抑制劑的培養基，中和殘留的胰蛋白酶，然后用移液管吹打分散細胞。但因為胰蛋白酶自身具有的引起細胞團聚不足之處，細胞不易形成穩定的單細胞懸液，從而影響到后續的實驗觀察；其次，在大規模工業化細胞培養中，生物反應器中也多采用0.25%胰蛋白酶液來消化培養細胞，消化結束后通過振動的方法將細胞從載體上分離下來。這種消化方法的不足是很難得到單分散的種子細胞，很多細胞以細胞團的形式存在，不利于細胞的均勻分布，影響了細胞在下級反應器培養中的生長。細胞懸液質量的好壞與消化液配方和消化方法密切相關。現有技術中的消化液對腫瘤細胞的消化效果還有待改進。?

天然酶是一種生物催化劑，結構復雜，價格昂貴，且易變性失活。而無機納米粒子模擬酶結構比天然酶簡單,?化學性質穩定,?具有酶的功能，還有高效、高選擇性和價廉易得等優點。金屬有機骨架材料（MOFs，也稱為金屬有機分子篩）是一種類似沸石分子篩的輕質材料，其具有自組裝的活性中心、較大的比表面積和孔隙率及其結構的可調控性、高滲透性等特性，可滿足催化、分離、能量儲藏與釋放的需要。目前關于這一材料的模擬酶研究正處于探索階段，相關報道還極為缺乏，且已報道的幾例主要側重于過氧化氫酶的模擬研究，尚無見模擬胰酶的報道。本發明報道了MOF-199可以模擬胰蛋白酶消化液的作用。??

發明內容

本發明的目的在于，提供一種能有效、快速將腫瘤細胞樣品分散為單細胞懸液的消化液。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，一種用于分離腫瘤細胞的模擬酶消化液，所述消化液為0.1?%?MOF-199磷酸緩沖液。?

本發明發現，0.1?%?MOF-199消化液與腫瘤細胞作用后，90?%以上貼壁細胞可以成功脫落并分散開，在不使用乙二胺四乙酸（EDTA）的條件下得到穩定的單細胞懸液；本發明還發現，在抽出消化液后，細胞能正常生長傳代。?

本發明的有益效果是：1.?消化液成分簡單，方便使用。?2.?能夠有效分離90%以上的貼壁細胞。3.?能夠有效防止細胞團聚，形成穩定的單細胞懸液，為下一實驗奠定了基礎。?

附圖說明

圖1為本發明消化液組與對胰酶組消化A549肺癌細胞效果對比圖。?

圖2為本發明消化液組消化的A549肺癌細胞24?h后的生長形態圖。(a,?d)?對照組；?b,?0.1%?MOF-199?作用10?min；c,?0.25%?Trypsin-0.02%EDTA作用2?min；e,?0.1%?MOF-199作用后用完全培養基恢復培養24?h；f,?0.25%?Trypsin-0.02%EDTA消化后用完全培養基恢復培養24?h。??

具體實施方式

本實施例按組成成分設計下述三個實驗組，每組針對同樣量的貼壁腫瘤細胞進行消化。1.?消化液組：0.1?%?MOF-199磷酸緩沖液。2.?胰酶組：0.25?%?胰蛋白酶+0.02%?EDTA。3.?對照組：正常細胞。?

參見圖1所示，同樣量的A549貼壁細胞經消化液組消化10?min后，細胞皺縮變圓，細胞間隙增大，部分細胞漂浮。90%以上貼壁腫瘤細胞脫落并分散開，形成穩定的單細胞懸液。?

參見圖2所示，用消化液組消化得到的細胞，用完全培養基（其組成成分：胎牛血清20%，青霉素100?IU/mL，鏈霉素100μg/mL，DMEM補充到100?%）培養，細胞能繼續生長，仍能具有良好形態，并可繼續傳代。恢復培養后的細胞形態與對照組相似。?