[發明專利]多核苷酸作圖和測序

有效

• 申請號: 201410584764.X
• 申請日: 2009-11-18
• 公開（公告）號: CN104372080B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 肖明;曹涵;帕里克史特·A·德施潘德;邁克爾·博伊斯-加西諾
• 申請（專利權）人: 博納基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司11219
• 代理人: 楊青,穆德駿

本申請為國際申請日2009年11月18日、國際申請號PCT/US2009/064996于2011年7月13日進入中國國家階段、申請號200980154567.1、發明名稱“多核苷酸作圖和測序”的分案申請。

相關申請

本申請要求2008年11月18日提交的美國申請No.61/115,704的優先權，通過參考將其全部內容納入本文以用于任何和所有的目的。

技術領域

本公開的發明涉及核酸測序領域和分子成像領域。本公開的發明還涉及納米技術領域。

背景技術

隨著分子生物技術的進展，對于以不斷增加的分辨率和精確度來分析越來越小的樣本有了更多的興趣。這其中的一部分受到種群異質性可經常掩蓋樣本的重要特征這一認識的驅動。有限的樣本體積也是一些應用的考慮因素。

雖然現有的技術在理論上能夠從身體小樣本(physically small sample)中提取重要信息，但是這類技術的有效性受限于它們在這樣的小樣本上分辨結構特征的能力。因此，在本技術領域中對于能夠基于單分子或其它身體小樣本獲得基因組信息的方法和相關裝置有需求。如果這類方法能夠改進到超過目前技術所達到的1000bp(1kb)的精確度的話，那么這類方法的價值將會提高。

發明內容

為了應對所述挑戰，要求保護的本發明首先提供了用于分析一個或多個外顯子的存在或相對位置的方法，所述方法包含分別使用第一和第二標記物來標記生物聚合物上的第一和第二位置，使得所述第一和第二標記物位于包括至少一個常外顯子(constant exon)的所述生物聚合物的第一區域的兩側；以及對所述生物聚合物進行線性化，并將所述第一和第二標記物之間的距離與生物聚合物的所述第一區域中可變外顯子(alternative exon)的存在、不存在、或相對位置聯系起來。

在第二個方面，本發明提供了獲得關于DNA樣本的結構信息的方法，其包含使用序列特異性切口核酸內切酶(nicking endonuclease)使第一個雙鏈DNA樣本產生切口；使一個或多個染料標記的核苷酸摻入通過所述切口核酸內切酶所產生的兩個或更多個切口位點處；對包括至少兩個染料標記的核苷酸的所述第一個雙鏈DNA樣本的一部分進行線性化；以及記錄兩個或更多個標記性染料標記的核苷酸的相對位置。

還提供了獲得關于核酸生物聚合物的序列信息的方法，其包含使具有第一結合序列的第一熒光標記序列特異性探針與單鏈核酸生物聚合物結合；使所述單鏈核酸生物聚合物與攜帶第一熒光標記物的第一終止核苷酸(terminator nucleotide)、與攜帶第二熒光標記物的第二終止核苷酸、與攜帶第三熒光標記物的第三終止核苷酸、以及與攜帶第四熒光標記物的第四終止核苷酸接觸；以及對所述核酸生物聚合物進行線性化和照射以確定與所述第一標記序列特異性探針相鄰的所述第一終止核苷酸、第二終止核苷酸、第三終止核苷酸、第四終止核苷酸、或其任何組合的存在或相對位置。

本發明還提供了獲得關于核酸生物聚合物的結構信息的方法，其包含使雙鏈生物聚合物與切口核酸內切酶接觸以產生第一切口位點；使所述第一切口位點與攜帶熒光標記物A的第一終止核苷酸、與攜帶熒光標記物B的第二終止核苷酸、與攜帶熒光標記物C的第三終止核苷酸、以及與攜帶熒光標記物D的第四終止核苷酸接觸；以及對所述雙鏈生物聚合物進行線性化和照射以確定所述第一終止核苷酸、第二終止核苷酸、第三終止核苷酸、第四終止核苷酸、或其任何組合的相對位置。

進一步提供了用于進行多重雜交(multiplex hybridization)的試劑盒，其包含各具不同顏色的多個雜交探針；以及將所述多個雜交探針中的至少兩個應用在核酸樣本上并線性化和成像至少一個雜交核酸的說明書。

附圖說明

當與附圖結合起來閱讀時，可對發明概要以及下面的詳細描述有進一步的理解。為了對本發明進行圖示說明，在附圖中顯示了本發明的示例性實施方案；然而，本發明不限于所公開的具體方法、組合物、以及裝置。另外，所述附圖不一定要按比例來繪制。在附圖中：

圖1A圖示說明了對于Nt.BstNBI切口核酸內切酶的作圖統計數據(mapping statistics)，其顯示100bp的光學分辨率顯著提高了圖譜的精確度和覆蓋度；

圖1B圖示說明了對于Nt.BspQI切口核酸內切酶的獨特作圖統計數據，其顯示100bp的光學分辨率對于圖譜的精確度和覆蓋度影響甚微；