[發(fā)明專利]一種臺(tái)灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410584582.2
• 申請(qǐng)日: 2014-10-28
• 公開（公告）號(hào): CN104351051A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張翔宇;陳杰;阮培均;吉云;嚴(yán)顯進(jìn);王彩云;王永
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 畢節(jié)市中藥研究所
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 遵義市遵科專利事務(wù)所 52102
• 代理人: 劉學(xué)詩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及植物的無性組織培養(yǎng)，尤其涉及臺(tái)灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗。

背景技術(shù)

臺(tái)灣肖楠（Calocedrus?formosana?(Florin)?Florin）又稱肖楠、黃肉仔、黃肉樹，柏科肖楠屬常綠大喬木，為臺(tái)灣特有裸子植物，分部于臺(tái)灣北部及中部海拔300～1900米的山地，為臺(tái)灣暖帶林（500~1800m）的主要造林樹種。是臺(tái)灣針葉樹五木之一。臺(tái)灣肖楠樹形為直干長圓錐狀，樹皮紅褐色，刀切后會(huì)流出淡紅色樹脂。材質(zhì)綿密，不易受白蟻蛀蝕，色澤偏黃褐色，為高級(jí)木材。與臺(tái)灣扁柏、紅檜、香杉、臺(tái)灣杉等同列臺(tái)灣針葉五木。雌雄同珠，球果木質(zhì)化，為長橢圓形，種子有兩翅。葉為鱗片狀，細(xì)小但比扁柏細(xì)長。由于過去的大力采伐天然林，致使臺(tái)灣肖楠天然族群量極稀少，且族群有高齡化傾向。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)表明臺(tái)灣肖楠母樹稀少，結(jié)實(shí)不佳，扦插繁殖成活率不高，且生長緩慢。（鐘鎮(zhèn)德，2000）以不同的育林作業(yè)方式，對(duì)臺(tái)灣肖楠開花結(jié)實(shí)的影響研究表明，以斷根、修枝及斷根且修枝等方式處理24年生的臺(tái)灣肖楠母樹，但連續(xù)兩年只促進(jìn)0~2.4%的植株開花，效果不佳。（忠興郭，2002）以GA₃對(duì)臺(tái)灣肖楠開花旺盛期進(jìn)行處理，93.9%可以開花，但雄花大量提前掉落，造成結(jié)實(shí)率不高。（郭寶章，1989）進(jìn)行臺(tái)灣肖楠扦插繁殖試驗(yàn)，但成活率不到2%,且成活的扦插苗生長緩慢。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前在大陸還未見有關(guān)臺(tái)灣肖楠組織培養(yǎng)、扦插等方面的報(bào)道。而臺(tái)灣學(xué)者在臺(tái)灣肖楠組織培養(yǎng)研究方面也未有較大突破，林志謀等（1997）指出未成熟胚添加600mg/Lcasein?enzymatic?hydrolysate、500mg/L?yeast?extract、0.5mg/L?BA及1mg/L?NAA的WPM培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)出芽，但出芽率較低。用4～6個(gè)月的實(shí)生苗莖段及葉片，在WPM+0.05?mg/LNAA+1mg/LBA可誘導(dǎo)腋芽發(fā)生，但芽體有玻璃化現(xiàn)象，以相同的外植體接種在WPM?+0.01mg/LBA+0.05mg/LTDZ培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率也僅僅能達(dá)到60%。愈傷組織在MS+?1mg/LNAA+0.1mg/LBA培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)效果較好，但愈傷組織再分化為叢生芽的效果不好。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析認(rèn)為：目前雖已有臺(tái)灣方面相關(guān)科研人員對(duì)臺(tái)灣肖楠進(jìn)行了組織培養(yǎng)方面的研究，但總體效果不好，未見完整的組培快繁體系報(bào)道，而本發(fā)明探索出了利用臺(tái)灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法，本發(fā)明具有一定的獨(dú)創(chuàng)性和新穎性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一套用臺(tái)灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，從而構(gòu)建了不依靠單純的種子繁殖或扦插繁殖進(jìn)行栽培的傳統(tǒng)種植模式，利用組培技術(shù)繁殖出的種苗最大限度的保持了母本的特性，同時(shí)可在短期內(nèi)獲得大量性狀一致、脫毒的臺(tái)灣肖楠無菌苗，為野生臺(tái)灣肖楠資源的保護(hù)、群落的恢復(fù)和利用臺(tái)灣肖楠在大陸地區(qū)作為退耕還林、植樹造林等的樹種及合理利用提供了一種新的技術(shù)支撐。

本發(fā)明可通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)

外植體培育

1）?將從臺(tái)灣引進(jìn)的一棵臺(tái)灣肖楠種植在基質(zhì)為腐殖土的盆中，視土壤含水量澆水，置于向陽通風(fēng)處備用，待需要外植體材料時(shí)，用不銹鋼剪刀剪取位于頂端新長出的葉片，作為外植體材料來源，外植體采集宜于在晴天的8:00~10:00進(jìn)行。

2）無菌苗獲取

?剪取的外植體材料，置于洗凈的燒杯中，滴入1-3滴普通洗潔精，1滴吐溫20，蓋上紗布并綁扎好，置于自來水下流水沖洗5h；沖洗后的外植體材料于超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精浸泡50s，用無菌水沖洗3次，而后將沖洗后的外植體用滅菌后的鑷子放入0.1%的升汞中消毒8min，無菌水沖洗6次，每次1.5min，然后將外植體放入事先準(zhǔn)備好的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌濾紙吸干材料上殘留的水分，接種前將葉片用無菌不銹鋼刀片切成1.5cm的小段，然后將切好的外植體接種到過渡培養(yǎng)基中，（MS(無肌醇)+0.01~3.0mg/LNAA+5~7g/L瓊脂）。

待在過渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)15~20d時(shí)，挑取無污染的外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

?3）愈傷組織誘導(dǎo)