[發明專利]一種苦瓜白粉病菌的保存方法

在審

• 申請號: 201410583749.3
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104293670A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 黃如葵;陳小鳳;黃熊娟;劉萌芽;黃玉輝;馮誠誠;陳振東;梁家作;劉杏連;車江旅
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 王正茂

技術領域

本發明屬于植物病理技術領域中一種專性寄生菌的保存方法，尤其是涉及一種苦瓜白粉病菌的保存方法。

背景技術

苦瓜(Momordica?charantia?L.)，又名涼瓜，是葫蘆科一年生攀緣草本植物。苦瓜是人們喜愛的一種蔬菜，原產地中國。在東南亞、中國、和加勒比海群島均有廣泛的種植。隨著苦瓜種植面積和規模的逐漸擴大，苦瓜病害發病率也日益嚴重。

苦瓜白粉病是苦瓜生產中常見的主要病害之一，屬于氣候性病害，主要在春秋兩季爆發流行，由于白粉病菌是一種專性寄生菌，只能寄生于活體寄主植物上，不能在人工培養基上培養，因此難以在離體的條件下進行純化和長期的保存。現有技術報道中的一些關于苦瓜白粉病菌的純化和保存方法大都是在春秋白粉病流行季節，將白粉病菌接種到感病的寄主植物上進行多次單對單轉接純化并保存，保存期限大概一個月左右。此類方法具有受環境和季節影響，占用空間大，工作量大和保存時間短的缺點，同時由于田間的白粉病菌含有大量雜菌造成純度較低，不能滿足后續研究工作的需求，比如白粉病菌鑒定、分子生物學研究、殺菌劑研制等都需要大量的純化的活體致病菌。因此，迫切需要一種高效的苦瓜白粉病菌的純化和保存方法。

發明內容

本發明根據苦瓜的白粉病菌只能寄生于活體植物上的特點，提供一種苦瓜白粉病菌離體條件下的保存方法。

為了實現上述目的，本發明通過以下技術方案來實現的：

一種苦瓜白粉病菌的保存方法，是將田間發病葉上的白粉菌接種到易感病的健康離體苦瓜葉片表面，置于28℃/16h、20℃/8h光暗交替條件下保濕培養，產生新的白粉層后，在無菌條件下，挑出單個孢子或單條孢子梗，接種到無菌苗的離體葉片上純化，產生新菌落后接種到無菌苦瓜子葉上，待子葉表面產生新菌落時，再置于溫度10℃～12℃、8h/16h光暗交替的條件下密封保存，在離體條件下，本方法可以保存白粉病菌150d以上。

本發明所提供的技術方案，其步驟如下：

(1)苦瓜白粉病菌的誘導：先將苦瓜病葉上的白粉菌接種到健康離體苦瓜葉片上，然后將離體苦瓜葉片放入培養皿中，密封置于光暗交替條件下保濕培養，誘導新的白粉病菌；

(2)苦瓜無菌葉片和無菌子葉的準備：將易感病材料的種子消毒后接種于培養基中，獲得無菌苗后，將長至寬3cm左右的葉片切下放入培養皿中待用；從下胚軸1cm處切下帶子葉的莖段并去掉側芽，插入每孔盛有3ml營養液的12孔細胞培養板孔內，將細胞培養板放入消毒的帶蓋盒子中待用；

(3)苦瓜白粉病菌的純化：在無菌條件下，將誘導新生成的白粉病菌，在解剖鏡下挑出單個孢子或單根孢子梗，接種到準備好的無菌苗離體葉片上，密封置于光暗交替條件下保濕培養純化；

(4)苦瓜白粉病菌的保存：將純化后的白粉病菌接種到插入盛有營養液的細胞培養板孔內的無菌子葉上，再將細胞培養板放入消毒的帶蓋盒子中，密封置于光暗交替條件下進行培養，待子葉表面生產新的菌落后，再置于溫度10℃～12℃、光暗8h/16h條件下保存。

作為優選，步驟(1)中所述葉片為易感病材料側枝上新生的第4～5張且小于9cm的幼嫩葉片。

作為優選，步驟(1)、(3)中所述光暗交替條件為28℃/16h，20℃/8h，光照強度為2000Lux。

作為優選，步驟(4)所述光暗交替條件為溫度10℃～12℃、光暗8h/16h，光照強度為2000Lux。

作為優選，步驟(2)中所述培養基為外加蔗糖20g/L、瓊脂7g/L的MS培養基；所述營養液為外加苯并咪唑100g/L、蔗糖15g/L的1/2MS培養基，其中1/2MS為大量元素減半的MS培養基。

本發明的有益效果

1、本發明利用苦瓜子葉生命周期長的特點，將純化后的白粉病菌在苦瓜子葉上進行保存，打破了環境和季節對白粉病發病的制約，本發明的保存方法具有占用空間小、保存時間長的優點。

2、本發明解決了當前苦瓜白粉病菌保存時間短的問題，為苦瓜白粉病的鑒定和防治，苦瓜抗白粉病新品種的選育以及苦瓜白粉病菌生物學研究提供極大方便，具有較高的應用價值。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。

實施例

1、供試的植物材料