[發明專利]用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組和試劑盒

在審

• 申請號: 201410583682.3
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104263847A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 師永霞;黃吉城;李燕;李小波;蘇錦坤;鄭夔;方盛藩;馮慶文
• 申請（專利權）人: 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 曹愛紅

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組和試劑盒。

背景技術

目前瘧疾診斷的主要方法以鏡檢和膠體金為主。鏡檢不但需要操作者具有豐富的經驗，而且有一定的局限性。當原蟲密度較低(<50個/μl血)時，靠鏡檢難以查到原蟲，容易出現漏診；由于國內少見三日瘧和卵形瘧，容易將兩者誤判為形態和臨床癥狀相似的間日瘧和惡性瘧；當發生瘧原蟲混合感染時，鏡檢不易將惡性瘧的環狀體或早期滋養體與間日瘧的環狀體區分開，特別是用藥后蟲體形態發生變化，蟲種鑒別較難，容易出現誤診，并只按單一瘧原蟲感染進行治療，影響治療效果；鏡檢耗時，不適用于大量人群的篩查。因此，傳統的“金標準”鏡檢法已不是瘧疾評價效率較高的診斷方法。瘧疾的膠體金雖然快速，但對原蟲密度低的血樣也易漏診，而且僅能判斷惡性瘧感染，不能區分間日瘧、三日瘧和卵形瘧感染以及混合感染。為了配合衛生部和檢驗檢疫機構等多部委制定的“中國消除瘧疾行動計劃(2010-2020年)”，有效控制輸入性瘧疾尤其是惡性瘧的傳入，檢驗檢疫機構必須在口岸加強對自東南亞、非洲等瘧疾高流行區返鄉人員瘧疾的檢測和監測，迫切需要建立瘧疾新型的快速、準確和高效的檢測方法。

多重實時熒光PCR技術是將PCR技術和多色熒光標記探針相結合的先進技術，該方法具有快速、特異、靈敏、自動化程度高等特點，結合防污染技術處理，特別適合于大規模、快速診斷的需求。該技術采用多色熒光對多條種特異性探針進行標記，配合多重PCR技術，可以在同一個PCR反應管中對多個病原體同時進行擴增，各色熒光的增長信號與相應PCR產物的增長量成等比關系，并被自動化熒光檢測儀收集，最后可通過分析熒光增長曲線達到診斷病毒類型的目的；反應時間快，整個反應約0.5小時-1小時完成；不需要檢測后的電泳操作，減少了實驗室污染。但目前尚未見多重熒光PCR用于瘧原蟲分型檢測。

發明內容

為克服上述技術缺陷，本發明提供了用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組和試劑盒。該引物探針組和試劑盒可以實現對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲快速簡便的分型檢測。

本發明的瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組，其核酸序列如SEQ?ID?NO：1-12所示。所述分型包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型別。

本發明的用于瘧原蟲多重熒光分型檢測試劑盒，包括主反應液混合物，還包括引物探針組，所述引物探針組的核酸序列如SEQ?ID?NO：1-6所示，所述核酸序列如SEQ?ID?NO：1-2所示的序列作為公共引物，用于對瘧原蟲的檢測，所述核酸序列如SEQ?ID?NO：3-6所示的序列作為探針，分別用于對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲進行分型檢測。

具體如下：

SEQ?ID?NO：1??5`-TGTTGCAGTTAAAACGCTCG-3`

SEQ?ID?NO：2??5`-TCAATTTTGTTATTCCATGCTGT-3`

惡性瘧原蟲(PF)的探針5端標記FAM、3端標記BHQ1，擴增長度為289bp，探針的核酸序列如下：

SEQ?ID?NO：3PF-P?5`-FAM-CCGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGG-BHQ1-3`

間日瘧原蟲(PV)的探針5端標記VIC，3端標記BHQ2，擴增長度為264bp，探針的核酸序列如下：

SEQ?ID?NO：4PV-P?5`-VIC-TGATACTTCGTATCGACTTTGTGCGCAT–BHQ2-3`

三日瘧原蟲(PM)的探針5端標記ROX，3端標記BHQ2，擴增長度為300bp，探針的核酸序列如下：

SEQ?ID?NO：5PM-P?5`-ROX?AGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTG-BHQ2-3`

卵形瘧原蟲(PO)的探針5端標記CY5，3端標記BHQ2，擴增長度為290bp，探針的核酸序列如下：

SEQ?ID?NO：6PO?5`-CY5-ACAACGTATCTGTTCTTTGCATTCCTTATG-BHQ2-3`

利用本發明的瘧原蟲多重熒光檢測試劑盒按如下方法檢測，多重熒光PCR反應選用的QPCR主反應液混合物為試劑盒HR?Qpcr?Master?Mix(中國CYbio公司產品)中的主反應液混合物，每個反應管的反應體系如下：

2×QPCR主反應混合物：12.5μl；

10μM正向引物：1.25μl；