[發明專利]一種高提取率高活性促肝細胞生長素的制備方法

在審

• 申請號: 201410583540.7
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104388510A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 王康林;馬婕;陳玉海
• 申請（專利權）人: 合肥平光制藥有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34
• 代理公司: 合肥市長遠專利代理事務所(普通合伙) 34119
• 代理人: 程篤慶;黃樂瑜

1.一種高提取率高活性促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、乳豬肝預處理：取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結締組織，清水洗凈，瀝水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細條狀，再置于絞肉機中絞成粒徑為1-3mm的乳豬肝顆粒；

S2、均質：將S1得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3100-3250rpm的轉速研磨2-3.5min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為5-6:4.5-5.5加入攪拌機中，以310-325rpm的轉速攪拌14-17min得到乳豬肝勻漿；

S3、胃蛋白酶的制備：取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應容器中，加入1.2-1.5wt％鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為22-25:27-30，將反應容器及其內容物置于47-50℃的水浴鍋中浸提63-66min得到浸提液，將浸提液以5800-6200rpm的轉速離心22-23min，取上清液進行低溫干燥得到胃蛋白酶；

S4、酶解：將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應容器中，滴加4-6mol/L鹽酸溶液至pH值為2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的轉速攪拌19-22min后，將反應容器及其內容物置于37-45℃的水浴鍋中水解6-8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99-101:0.7-1；

S5、滅活：將S4得到的酶解物料水浴加熱至81-82℃，保溫12-15min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；

S6、離心：將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4000-4300rpm的轉速離心14-17min后，將上清液取出滴加4-6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.8-7.2得到中性離心液；

S7、粗濾：將S6得到的中性離心液經過截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進行第一次過濾后，再經過截留分子量為10KD的中空纖維超濾裝置進行第二次過濾得到粗濾液，其中第一次過濾和第二次過濾的回流壓力為0.04-0.07MPa；

S8、超濾：將S7得到的粗濾液再經截流分子量為6000D的超濾膜進行超濾得到促肝細胞生長素溶液，其中進液壓力為0.13-0.16MPa，回流壓力為0.04-0.07MPa。

2.根據權利要求1所述高提取率高活性促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，S3中，取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應容器中，加入1.3-1.4wt％鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23-24:28-29，將反應容器及其內容物置于48-49℃的水浴鍋中浸提64-65min得到浸提液，將浸提液以5900-6100rpm的轉速離心22.3-22.6min，取上清液進行低溫干燥得到胃蛋白酶。

3.根據權利要求1或2所述高提取率高活性促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，S4中，將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應容器中，滴加4.5-5.5mol/L鹽酸溶液至pH值為2.7-3.2，再加入S3得到的胃蛋白酶以195-200rpm的轉速攪拌20-21min后，將反應容器及其內容物置于40-42℃的水浴鍋中水解6.7-7.8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99.4-100.2:0.8-0.9。

4.根據權利要求1-3任一項所述高提取率高活性促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，S6中，將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4100-4200rpm的轉速離心15-16min后，將上清液取出滴加4.7-5.6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.9-7.1得到中性離心液。

5.根據權利要求1-4任一項所述高提取率高活性促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、乳豬肝預處理：取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結締組織，清水洗凈，瀝水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細條狀，再置于絞肉機中絞成粒徑為1-3mm的乳豬肝顆粒；

S2、均質：將S1得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3200rpm的轉速研磨3min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為1:1加入攪拌機中，以315rpm的轉速攪拌15.5min得到乳豬肝勻漿；

S3、胃蛋白酶的制備：取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應容器中，加入1.3wt％鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23:28，將反應容器及其內容物置于490℃的水浴鍋中浸提65min得到浸提液，將浸提液以6000rpm的轉速離心22.5min，取上清液進行低溫干燥得到胃蛋白酶；

S4、酶解：將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應容器中，滴加5mol/L鹽酸溶液至pH值為3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的轉速攪拌20min后，將反應容器及其內容物置于40℃的水浴鍋中水解7h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為100:0.9；

S5、滅活：將S4得到的酶解物料水浴加熱至81.8℃，保溫14min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；

S6、離心：將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4200rpm的轉速離心15min后，將上清液取出滴加5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為7得到中性離心液；

S7、粗濾：將S6得到的中性離心液經過截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進行第一次過濾后，再經過截留分子量為10KD的中空纖維超濾裝置進行第二次過濾得到粗濾液，其中第一次過濾和第二次過濾的回流壓力為0.06MPa；

S8、超濾：將S7得到的粗濾液再經截流分子量為6000D的超濾膜進行超濾得到促肝細胞生長素溶液，其中進液壓力為0.14MPa，回流壓力為0.05MPa。