[發(fā)明專利]新城疫弱毒苗O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒緩釋劑的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410583419.4
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104324372A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙凱;王曉華
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號: A61K39/17
• 分類號: A61K39/17;A61K9/52;A61K47/48;A61P31/14;C08B37/08
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

1.新城疫弱毒苗O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒緩釋劑的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行：

一、O-2′-HACC的合成：

A、N-苯亞甲基殼聚糖的合成

將3-6g殼聚糖粉末溶于100-200mL體積百分濃度5％～15％的醋酸溶液中，在室溫下加入30-80mL無水乙醇，邊滴加邊攪拌，然后逐滴加入10-20g苯甲醛，30min內(nèi)加完，邊滴加邊攪拌，得溶液；向溶液中滴加1.0～2.0mol/L?NaOH溶液將溶液調(diào)至中性，真空抽濾析出沉淀，然后用甲醇多次洗滌沉淀除去未反應(yīng)的苯甲醛，將沉淀于35～50℃烘箱中放置20h，得纖維狀淺黃色固體N-苯亞甲基殼聚糖；

B、O-季銨鹽-N-苯亞甲基殼聚糖的合成

將30-80mL異丙醇和6-18g?2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨混合制成ETA的異丙醇溶液，取1.5-5.6g?N-苯亞甲基殼聚糖置于圓底燒瓶中，然后逐滴加入ETA的異丙醇溶液，在N₂保護(hù)條件下于60～85℃水浴攪拌反應(yīng)12～20h，過濾，依次用甲醇和丙酮洗滌沉淀，得乳白色固狀物O-季銨鹽-N-苯亞甲基殼聚糖；

C、O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的合成

向40-60mL?0.2-0.5mol/L氯化氫乙醇溶液中加入2-5g?O-季銨鹽-N-苯亞甲基殼聚糖，室溫?cái)嚢?4h后，減壓蒸餾20min，得膠狀物；然后向膠狀物中加入10-30mL蒸餾水充分溶解，再用丙酮沉淀，過濾，得固體，固體于80℃烘箱中烘干，得淺灰色固狀物O-2′-HACC；

D、樣品精制

取O-2′-HACC溶于去離子水中，用足量的丙酮進(jìn)行沉淀，3G砂芯漏斗抽濾，所得沉淀溶于蒸餾水中，置于透析袋中透析48h，每隔6h更換一次蒸餾水，待濃縮到2mL時(shí)，加入足量的丙酮重新沉淀，抽濾，所得固體真空干燥，得到精制的樣品O-2′-HACC；

二、NDV/La?Sota-O-2′-HACC-NPs的制備：

a、取O-2′-HACC溶于去離子水中配制成濃度為0.5-2mg/mL的O-2′-HACC溶液，然后取5mL?O-2′-HACC溶液并滴加1.25-7.5mL新城疫La?Sota株病毒液，磁力攪拌3min，獲得溶液A；

b、溶液A在室溫、無菌條件下以900-1300r/min磁力攪拌30s，然后滴加3.5mL濃度為0.5-3mg/mL的三聚磷酸鈉，維持在5min內(nèi)勻速滴完，繼續(xù)磁力攪拌5-30min，再滴加1mL的PBS，維持在5min內(nèi)勻速滴完，繼續(xù)磁力攪拌5-30min，然后滴加1mL的司班-80，維持在5min內(nèi)勻速滴完，繼續(xù)磁力攪拌5-30min，獲得溶液B；

c、將溶液B于4℃、8000-13000r/min離心10-30min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入濃度為0.01mol/L的PBS懸浮，獲得NDV/La?Sota-O-2′-HACC-NPs懸液；

d、在NDV/La?Sota-O-2′-HACC-NPs懸液中加入質(zhì)量濃度為5％的蔗糖脫脂奶，真空冷凍干燥24h，獲得新城疫弱毒苗O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒緩釋劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒緩釋劑的制備方法，其特征在于步驟一A中殼聚糖的脫乙酰度大于85％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒緩釋劑的制備方法，其特征在于步驟二a中新城疫La?Sota株病毒液的病毒含量為200μg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒緩釋劑的制備方法，其特征在于步驟二d中NDV/La?Sota-O-2′-HACC-NPs懸液與蔗糖脫脂奶的體積比為1∶1。