[發(fā)明專利]分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410582165.4
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104328088A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉云;楊超;包軍;姚薇;李超斯;童津津;李情
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

p27蛋白作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin?dependent?kinase?inhibitor，CKIs)，通過與各種細(xì)胞周期素-細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-CDK)復(fù)合物作用發(fā)揮廣譜的抑制CDK的活性，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性等功能，其活性的改變與細(xì)胞凋亡的發(fā)生存在明顯相關(guān)性。前期的研究結(jié)果表明，惡性腫瘤中p27表達(dá)量顯著降低，證明p27蛋白與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性，它也被認(rèn)為是具有潛在價(jià)值的獨(dú)立預(yù)后因子。進(jìn)一步對p27蛋白生物學(xué)功能的機(jī)制研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)。?

人類乳腺腫瘤以及其他的腫瘤細(xì)胞系過表達(dá)p27不僅誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和cyclin-CDK的活性降低，還能有效的促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。犬乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床上常見的疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對犬的健康構(gòu)成嚴(yán)重危害，尋求犬乳腺腫瘤診斷及預(yù)防的關(guān)鍵靶點(diǎn)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。因生活及飲食習(xí)慣更和人類接近，相比于鼠，犬是更為理想的實(shí)驗(yàn)動物模型，對于犬腫瘤的研究不僅對獸醫(yī)臨床有重要價(jià)值，對于人醫(yī)腫瘤臨床的研究也同樣具有重要意義。市面上銷售的針對p27蛋白的抗體均為針對人源或者鼠源，沒有針對犬源的，所以本發(fā)明制備犬27單克隆抗體，使人們能開展p27與犬乳腺腫瘤的相關(guān)研究具有重要意義。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的犬p27單克隆抗體能夠應(yīng)用于犬乳腺腫瘤病理組織樣品中p27蛋白的檢測。?

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：?

本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞株為能夠分泌犬p27單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞株已于2014年7月15日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)”，保藏號為CGMCCNo.9457。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101。該雜交瘤細(xì)胞株的建立是利用原核表達(dá)技術(shù)，表達(dá)犬p27蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴胞雜交瘤技術(shù)建立的特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫獲得的。用該雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證明，此單克隆抗體能有效的結(jié)合犬細(xì)胞內(nèi)p27蛋白。間接ELISA實(shí)驗(yàn)表明：雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價(jià)1∶∶6400。本發(fā)明的特點(diǎn)如下：?

1.本發(fā)明使用的免疫原是從經(jīng)RT-PCR方法克隆的犬p27基因，利用原核表達(dá)技術(shù)制備的犬p27蛋白。?

2.本發(fā)明所制備的單克隆抗體是針對犬種屬p27蛋白，具有種屬特異性，免疫組化實(shí)驗(yàn)證明其有效的?和犬腫瘤細(xì)胞中的p27蛋白結(jié)合，根據(jù)其結(jié)果可以對犬腫瘤患犬的診斷及治療提供指導(dǎo)意義。?

本發(fā)明篩選得到1株小鼠雜交瘤細(xì)胞(mus?musculus?hybridoma)3G8，已于2014年7月15日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)”，保藏號為CGMCCNo.9457。并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以期進(jìn)一步探討p27的蛋白水平與犬乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系。本發(fā)明中的單克隆抗體具有良好的特異性，為其在腫瘤以及其他疾病發(fā)生反應(yīng)中起到相應(yīng)的作用關(guān)系及其功能的深入研究提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)，為臨床上相應(yīng)的治療及預(yù)后提供了有效手段。?

附圖說明

圖1為犬p27基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果?

圖2為重組犬p27蛋白的SDS-PAGE及純化后的重組蛋白?

圖3為雜交瘤細(xì)胞形態(tài)?

圖4為雜交瘤細(xì)胞株染色體鑒定?

圖5為Western?blot分析單克隆抗體特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果?

圖6為單克隆抗體的免疫組化分析結(jié)果?

具體實(shí)施方式

實(shí)例1p27基因的克隆及測序?