[發(fā)明專利]Purα蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白編碼基因表達中的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410581731.X
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104387464A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設計）人: 崔建奇
• 申請（專利權）人: 寧夏醫(yī)科大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/63;G01N33/68;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;C12N1/15;A61K38/17;A61P25/28
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明公開了Purα蛋白，以及編碼此多肽的多核苷酸序列對淀粉樣前體表達的調(diào)控作用。

背景技術

淀粉樣前體蛋白(Amyloid?Precursor?Protien，簡稱APP)是一種廣泛存在于體內(nèi)的跨膜蛋白。它的異常代謝可以生成42個氨基酸組成的多肽(Amyloid?βPeptide，簡稱Aβ)，這種多肽在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的聚集可以產(chǎn)生Senile?plaque，而這種plaque由于可引起神經(jīng)組織的興奮性毒性的增強，激發(fā)炎癥反應和炎性因子的浸潤，并且可以阻斷和破壞神經(jīng)元之間的聯(lián)系，被認為是Alzheimer’s病形成的主要原因。APP的代謝異常，如過表達，可以產(chǎn)生早發(fā)性Alzheimer病的癥狀，所以對APP基因表達和調(diào)控方面的研究，對于治療Alzheimer病的發(fā)生和發(fā)展有著很重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

申請人通過長期研究發(fā)現(xiàn)，Purα蛋白和Egr-1蛋白(其序列表SEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列、編碼序列如序列表SEQ?ID?NO：4)是APP的編碼基因表達過程中兩個重要的調(diào)控因子。Purα蛋白對APP的表達有明顯的負調(diào)控作用，而Egr-1蛋白則表現(xiàn)出強烈的正調(diào)控作用。兩種因子共同作用，則Purα蛋白可以完全抑制Egr-1因子的正調(diào)控作用，也就是說Purα蛋白的結合位點與Egr-1蛋白的結合位點在APP的編碼基因啟動子區(qū)域是重合的。

基于上述研究成果，申請人完成了本發(fā)明。

首先，本發(fā)明公開了Purα蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白編碼基因表達中的應用，在該作用中，Purα蛋白結合APP編碼基因啟動子的5‘UTR區(qū)域9063-9077：ggcggcgg?tggcggc，并抑制Egr-1因子的正調(diào)控，Purα蛋白包括序列表SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。

由于Purα蛋白有效抑制APP的表達，因此本發(fā)明還公開了Purα蛋白作為拮抗劑或抑制劑，在診斷或治療與抑制淀粉樣前體蛋白異常表達相關的疾病中的應用。

如申請人在背景技術部分所提到的，上述疾病，主要為阿爾茨海默氏病，目前本領域技術人員普遍認為該疾病與APP的過表達高度相關。

進一步的，本發(fā)明還公開了診斷或治療與抑制淀粉樣前體蛋白異常表達相關的疾病的藥物組合物，包含上述的Purα蛋白與藥學上可接受的載體。

本發(fā)明還公開了編碼Purα蛋白的多核苷酸，具有序列表SEQ?ID?NO：2的核苷酸序列。

基于上述多核苷酸，本發(fā)明還公開了一種含有外源多核苷酸的重組載體，由多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或表達載體構建而成的重組載體。

本領域技術人員熟知上述重組載體的構建方法，是將編碼Purα蛋白的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。其中所用的載體指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構建重組表達載體。

為了構建上述重組表達載體，可以使用生物學領域任何已知的方法，這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等，通過將編碼Purα蛋白的DNA序列有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的lac或trp啟動子；噬菌體的PL啟動子，和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。

在上述基礎上，本發(fā)明還公開了含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，選自于下列一種宿主細胞：(a)用所述重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；或(b)用所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。

利用上述的宿主細胞，選擇合適的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，，即可分離純化獲得Purα蛋白。

上述的宿主細胞指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤細胞等。