[發明專利]寡核苷酸序列及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410576464.7
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104388422B
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: 鄭江;鄢慶枇;郝聚敏;唐花
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙)35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及哈維氏弧菌的識別檢測，尤其是涉及可用于滅活哈維氏弧菌識別檢測的寡核苷酸序列及其制備方法與應用。

背景技術

在養殖業中，每年約有10％的水產養殖動物死于感染性病害，其中弧菌感染導致的疾病占了相當大的比重。雖然化學藥品和抗生素可控制其感染，但是藥物防治常會產生不良后果，如在水產動物體內積累、殘留，容易產生耐藥菌株和易污染環境等問題，因此建立病原弧菌的快速檢測技術，以提早防治病害的發生和流行仍是目前的主要手段。

目前，弧菌的檢測方法主要是根據伯杰氏細菌鑒定手冊，通過對微生物的生理生化特征檢測進行鑒定，由于需要測試的項目較多，因此該方法工作量較大、操作較繁瑣。16SRNA的分子生物學方法雖有較高的準確性，但需要提取病原菌的16SRNA，手續較繁瑣，且對檢測設備有一定要求，難以實現現場的快速檢測需要；免疫學方法制備的抗血清雖能實現快速檢測，但由于制備的抗血清為多克隆抗體，實際應用中可能會出現假陽性或假陰性，即使采用單克隆抗體。由于制備技術要求較高、周期較長，因此其應用受到限制。

指數富集配體進化技術(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，簡稱SELEX技術，是近年來新發展起來的一種系統篩選技術。它利用寡核苷酸分子可在空間形成多種多樣的三維結構，通過構建的隨機寡核苷酸庫，從中篩選出與目標靶分子有特異識別作用的高親和力的寡核苷酸分子——適配子，其分子識別能力可達到甚至超過了單克隆抗體的水平，而制備技術則比單克隆抗體簡單、快速。運用該技術目前已篩選出腫瘤細胞、炭疽桿菌等的適配子，可用于腫瘤細胞和炭疽桿菌的檢測、識別。

SELEX技術的出現為微生物的快速檢測提供了新的研究思路，其應用也將越來越廣泛。在SELEX篩選中，以滅活菌為靶目標進行篩選，不僅具有較好的安全性，而且使目標菌的形態相對穩定和固定，從而有效提高了篩選的效率和效果。同時，以滅活菌為靶目標，還能有效避免環境因子對活菌的影響，使篩選的穩定性得到較好的改善。因此，開展以滅活菌為靶目標的SELEX篩選，具有重要意義。

哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是水產養殖中的重要條件致病菌，它不僅能引發多種水產動物發病，還可以通過食物鏈引起食物中毒，威脅到人類的健康。因此，運用SELEX技術篩選滅活哈維氏弧菌適配子，并將其應用于滅活哈維氏弧菌的識別鑒定，能大大提高哈維氏弧菌檢測的靈敏度和特異性，成為本發明的重點。

本申請人在中國專利201110259244.8中已公開了3條適配子序列，分別如下：

序列1：5′-GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′；

序列2：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3′；

序列3：5′-GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′。

本申請人在中國專利201110090419.7中已公開了4條適配子序列，分別如下：

8號適配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGT GAACGGAGGG GGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

10號適配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAA GGACTGTGTC GAGTGTTG GC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

37號適配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTA GGAGGGCCAC AGTGGACT GCACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

46號適配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTC-3′。

本申請人在中國專利201210079530.0中已公開了4條適配子序列，分別如下：