[發明專利]一種制備河豚毒素的方法

有效

• 申請號: 201410573138.0
• 申請日: 2014-10-19
• 公開（公告）號: CN104370929A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 鐘馨稼;劉延東
• 申請（專利權）人: 鐘馨稼;劉延東
• 主分類號: C07D491/22
• 分類號: C07D491/22
• 代理公司: 深圳市中知專利商標代理有限公司 44101
• 代理人: 張皋翔

1.一種制備河豚毒素的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

步驟一：浸泡

將河豚魚肝或魚子切成條或塊后，用去離子水或純化水浸泡，得到料液，浸泡至料液不再含毒為止；

步驟二：沉降

將步驟一所得的料液置于6～10℃沉降放置10～12小時，分出上清液，并將沉淀物離心并過濾除渣后再與上清液混合得到澄清液；

步驟三：絮凝

將步驟二所得的澄清液用氨水溶液調PH至7～9，加入絮凝劑溶液調節PH至4～6，攪勻，靜置沉降，然后分出上清液，并將沉淀物經過高速離心并過濾除渣后再與上清液混合；

步驟四：離子交換

將步驟三混合所得的料液，上離子交換柱，交換至PH6.5～7.0,交換結束后用去離子水或純化水沖柱至澄清，然后以醋酸溶液洗脫，收集含目標產物的組分，以氨水溶液調PH至5～7，減壓濃縮得到濃縮液。

步驟五：低壓柱層析

將步驟四所得的濃縮液和干硅膠拌好，上低壓硅膠柱進行分離，并加入組成為正丁醇、醋酸和水的洗脫液進行洗脫，收集含目標產物的流出液部分，過濾得到濾液，減壓濃縮得到濃縮液。

步驟六：高效液相色譜柱

將步驟五所得濃縮液注入平衡后的高效液相色譜柱,以醋酸溶液洗脫，收集含目標產物的流出液減壓濃縮，得到濃縮液。

步驟七：結晶

將步驟六所得的濃縮液用氨水溶液調PH至8～9，冷藏，析出結晶，濾出，用無水乙醇洗滌，常溫減壓干燥即得河豚毒素高純單體結晶。

2.根據權利要求1所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟一中，所述河豚魚肝或魚子是切成1～2cm的條或塊，置不銹鋼浸泡槽中加1～2倍的去離子水或純化水在6～10℃浸泡，并適時攪拌，18～24小時后將料液從不銹鋼浸泡槽的下口放出至儲料槽或沉降罐中。

3.根據權利要求2所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟三中，是將步驟二所得的澄清液用25％的氨水溶液調PH至7～9，加絮凝劑溶液至PH4～6，以50～300rpm/min的速度攪拌5～10min，在溫度為6～10℃下靜置沉降18～24小時，分出上清液后，將沉淀物經過高速離心機，在轉速為5000～10000rpm/min下離心20～40分鐘，并過濾除渣后再與上清液混合。

4.根據權利要求3所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述絮凝劑為聚合硫酸鐵、聚合硫酸鋁、聚丙烯酰胺或聚合氯化鋁，投放量為0.01～5g/L。

5.根據權利要求4所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟四中，是將步驟三混合所得的料液，上經氨化并用水沖至PH8～9的離子交換柱，交換至PH6.5～7.0,其中料液和離子交換樹脂之間的量比為40～60ml/g，交換結束后用去離子水或純化水沖柱至澄清，然后以5～10％的醋酸溶液洗脫，醋酸溶液與上的料液的體積比為1：90～180，收集含目標產物的組分，以氨水調PH至5～7，在0.9～1.0大氣壓下濃縮90～100倍，得到濃縮液。

6.根據權利要求5所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟四中的離子交換柱所用的離子交換樹脂為D152弱酸型大孔丙烯酸陽離子交換樹脂。

7.根據權利要求6所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟五中，是將步驟四所得的濃縮液，和干硅膠拌好，兩者的量的比例為0.8～1ml/g，上低壓硅膠柱進行分離，壓力為0.7～0.9個大氣壓，加入組成為正丁醇、醋酸和水的洗脫液進行洗脫，洗脫液與上的料液的體積比為50:1，其中正丁醇、醋酸和水的體積比分別為5：3：1,收集含目標產物的流出液部分，用0.45um微孔濾膜過濾，得到濾液在0.9～1.0個大氣壓下90～100倍濃縮，得到濃縮液。

8.根據權利要求7所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟六中，是將步驟五所得濃縮液注入平衡后的高效液相色譜柱,高效液相色譜柱為C18柱，上樣量為0.2～0.4ml，以體積百分比為0.4～0.6％的醋酸溶液洗脫，洗脫液與上的料液的體積比為80～150:1，用示差折光監測器監測，收集含目標產物的流出液在0.9～1.0個大氣壓下90～100倍濃縮，得到濃縮液。

9.根據權利要求8所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步驟七中，是將步驟六所得的濃縮液用體積分數為8～10％的氨水調PH至8～9，冷藏，析出結晶，濾出，用無水乙醇洗滌，在-1.1～-0.9個大氣壓下，常溫干燥24～48小時即得河豚毒素高純單體結晶。