[發(fā)明專利]一組產(chǎn)河豚毒素的海洋細菌組合

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410570683.4
• 申請日: 2014-10-23
• 公開（公告）號: CN104328070A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 仵小南
• 申請（專利權(quán)）人: 天津瑞麟祥生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/18;C12R1/07;C12R1/63
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 楊慧玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明創(chuàng)造涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及由微生物發(fā)酵生產(chǎn)河豚毒素原料，特別是一組產(chǎn)河豚毒素海洋細菌篩選和育種方法。

背景技術(shù)

河豚毒素是存在于產(chǎn)河豚毒素魚類(俗稱河豚魚)及其他生物體內(nèi)(如一些藻類或微生物)的一種生物堿類天然毒素。河豚毒素是屬于毒性最強的一類天然毒素，其毒性比氰化鈉還強1000倍。河豚毒素是典型的鈉離子通道阻斷劑，它能選擇性與肌肉、神經(jīng)細胞的細胞膜表面的鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴性鈉離子通道，從而阻滯動物電位，抑制神經(jīng)肌肉間興奮的傳導，導致相關(guān)的生理機能的障礙，主要造成肌肉和神經(jīng)的麻痹。

中國是全世界河豚魚產(chǎn)量最多的國家，現(xiàn)初步查明的全球54種中，中國有35種，大部分為東方鲀屬，分布在東海、黃海、渤海等水域。年產(chǎn)量約在3-4萬噸，占世界河豚魚總產(chǎn)量的70％左右。隨著幾種主要東方鲀品種的人工繁殖與苗種培育的成功，加速推進了中國河豚魚人工養(yǎng)殖的發(fā)展。

河豚毒素的英文名稱：Tetrodotoxin，縮寫作TTX。分子式C11H17N3O8，分子量319.27?；瘜W名稱：八氫-12-(羥甲基)-2-亞氨基_5，9，7，IOa-二甲基-10aH-[l，3]二氧橋[6,5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-五醇。見說明書附圖1。

河豚毒素主要用于鎮(zhèn)痛和戒毒，也可以用于治療外傷性疼痛、神經(jīng)性疼痛、癌癥疼痛、術(shù)后疼痛，還有治療皮膚病如濕疹、癬、疥等，還有去腐生新的作用如燒傷、燙傷、癤、癰等的治療，在壯陽及治療女性性冷淡方面也有良好的療效，也有關(guān)于治療高血壓等相關(guān)的報道。河豚毒素的主要特點就是它不具備成癮性，因此得到廣泛用途。

河豚毒素的生產(chǎn)目前有三種途徑，一種就是傳統(tǒng)意義上的從河豚魚內(nèi)臟提取分離的辦法，該方法步驟繁瑣、得率低、產(chǎn)品純度有限，而且大量消耗河豚資源，對生態(tài)環(huán)境造成破壞。第二種途徑是用化學方法人工合成，但步驟冗長、難度大，目前尚無實際應(yīng)用價值。第三種途徑就是通過微生物發(fā)酵的方法獲得河豚毒素，但是這種方法的局限是產(chǎn)品水平低下、菌種遺傳特征不穩(wěn)定，因此基本處于實驗室研究階段。以上這些因素嚴重制約河豚毒素的產(chǎn)量。

由于河豚毒素有廣泛的用途，但其產(chǎn)量有限，因此該產(chǎn)品在市場上供不應(yīng)求、價格高昂。許多企業(yè)和研究機構(gòu)都投入大量人力物力，企圖找到解決這一難題的途徑。到目前為止，效果并不明顯。

我們經(jīng)過十數(shù)年的努力，在菌種選育、復壯、發(fā)酵選育、細胞工程改造、生物技術(shù)改造等方面工作的基礎(chǔ)上，篩選出一組海洋微生物菌種，該組微生物保持了穩(wěn)定的遺傳特征和穩(wěn)定的河豚毒素產(chǎn)率；微生物能產(chǎn)生具有較高含量的河豚毒素，且所獲菌株傳代10代以上，遺傳性狀穩(wěn)定。

同時，也對該組微生物的培育條件進行了優(yōu)化，從而使得微生物的生長條件和產(chǎn)生河豚毒素的條件更加穩(wěn)定，這些都為河豚毒素的產(chǎn)業(yè)化奠定了生物學基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明創(chuàng)造要解決的問題是提供從海洋微生物中通過相關(guān)的手段篩選出一組協(xié)同生產(chǎn)河豚毒素的海洋細菌，該組海洋細菌具有遺傳特征穩(wěn)定，產(chǎn)毒素含量較高的特點。解決現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分難題，以及提供改進的方法。本發(fā)明的方法將提供高產(chǎn)量的TTX，因而克服了使用有限的河豚魚資源的難題，同時容許微生物持續(xù)保持生產(chǎn)毒素的特征。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明創(chuàng)造采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明涉及到一組海洋微生物的選擇，這些微生物可能具有生產(chǎn)河豚毒素的特征。

本發(fā)明也涉及通過人工選育和生物技術(shù)的方法，使得所選用的菌種能夠持續(xù)保持穩(wěn)定的遺傳特征和持續(xù)生產(chǎn)毒素的能力。

本發(fā)明還涉及到一種經(jīng)過改進的培養(yǎng)上述微生物組的合理有效的方法和條件。

在本發(fā)明的第一個方面中，提供了獲得由細菌菌株產(chǎn)生的河豚毒素的可持續(xù)的方法，所述細菌菌株能夠在培養(yǎng)介質(zhì)中產(chǎn)生所述毒素，包括：

a)從許多海洋動物內(nèi)臟或血液以及海洋植物表面中分離提取海洋微生物；

b)所述海洋動物包括但不限于章魚、天使魚、鱈魚、翻車魚、鲀科魚、海星、螃蟹、蝸牛、扁形蟲、軟體動物等；

c)所述海洋植物涵蓋海洋綠藻、褐藻、紅藻等多種藻類；