[發(fā)明專利]用于生產丙型肝炎病毒多表位疫苗的表達載體PVX?6His?CTBt?Bt

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410569549.2
• 申請日: 2014-10-23
• 公開（公告）號: CN104353071B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 孔令保;黃明潔;郭韞麗
• 申請（專利權）人: 江西農業(yè)大學
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29;A61K39/39;A61P31/14
• 代理公司: 江西省專利事務所36100
• 代理人: 張文

技術領域

本發(fā)明涉及抗病毒疫苗研發(fā)領域，尤其是涉及一種用于生產丙型肝炎（丙肝）病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6His-CTBt-Bt。

背景技術

丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子，該病毒感染的世界總人數超過1.7億，我國感染人數超過4000萬。大多數丙型肝炎病毒感染者為持續(xù)性感染，進而引起慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。據報道，全球40%的慢性肝病和80%的肝細胞癌與丙型肝炎病毒有關，每年全球用于丙肝治療費用超過1000億美元。現有的治療藥物只對部分丙型肝炎肝病毒感染者有效，且治療時間長，成本高和有副作用。疫苗是防治，特別是預防病毒性疾病的一種極其經濟、簡單和有效的手段。但是，至今還沒有疫苗來預防和治療丙型肝炎病毒感染。因此，研發(fā)具有自主知識產權的丙型肝炎病毒（特別是難治性丙型肝炎病毒）基因工程多表位疫苗具有極其重要的科學價值、無可估量的商業(yè)價值和社會效益。

植物作為制備基因工程疫苗生物反應器具有生產成本低、安全性好、可口服、容易運輸和保存等優(yōu)點，因而成為近年來國際上疫苗研究和生產的一個熱點和發(fā)展趨勢。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于生產丙型肝炎病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6His-CTBt-Bt。

本發(fā)明的目的是這樣實現的：

（1）疫苗氨基酸組成設計：

丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸組成設計：從N端至C端依次為6個組氨酸（便于疫苗純化），口服免疫佐劑霍亂毒素B亞單位CTB（增強疫苗口服免疫效果），難治性丙型肝炎病毒基因型1的6個B細胞中和抗原表位Bt（E1_313-327aa-E2_396-424aa-E2_438-447aa-E2_523-540aa-E2_610-627aa-E2_631-648aa）。各個抗原表位之間通過一個甘氨酸和一個絲氨酸殘基隔開）。

（2）疫苗密碼子優(yōu)化：

為了促進疫苗基因在煙草的高表達，利用偏愛密碼子在線分析軟件http://www.bioinformatics.org/codon/cgi-bin/codon.cgi分析，合成6His-CTBt-Bt疫苗所需的優(yōu)化密碼子序列。

（3）疫苗基因合成

為了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表達，對上述優(yōu)化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密碼子序列，在其5’端引入ClaI酶切位點和煙草偏愛Kozak序列，3’端引入終止密碼子和SalI酶切位點。使用在線分析軟件http://helixweb.nih.gov/dnaworks/ 設計22條引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。

（4）疫苗表達載體構建及鑒定測序：

PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和馬鈴薯X病毒載體PVX201，使用ClaI和SalI雙酶切，連接，獲得疫苗表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，對表達載體進行酶切和測序鑒定。

（5）疫苗在煙草的表達和Western blot鑒定：

金剛砂磨損煙葉葉片，在磨損處接種疫苗表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，同時以馬鈴薯X病毒PVX201（陰性對照）和PVX204（攜帶GFP基因接種煙葉作為對照，每個葉片接種病毒載體量為2-4μg。通過觀察GFP蛋白表達驗證、優(yōu)化病毒接種和復制效果,制備煙草的蛋白提取物，分別使用鼠源的6×His Tag抗體（LanPower?）和CTB抗體（antibodies-online Inc），Western blot檢測疫苗表達。Ni柱純化表達的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt。

（6）動物實驗測定疫苗的免疫特性和安全性：