[發(fā)明專利]固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2600的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410568342.3
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104277098A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姬明放;張震
• 申請（專利權(quán)）人: 申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）有限公司
• 主分類號: C07K14/09
• 分類號: C07K14/09;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2600的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1、將2-氯-3-苯甲基氯樹脂、三苯甲基醇樹脂或4-羥甲基-3-甲氧基丁酸樹脂置于二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中10～120min，充分溶脹，所得溶脹樹脂溶液中樹脂的濃度為0.05～0.2g/ml；

步驟2、向步驟1所得溶脹樹脂溶液中加入9-芴甲氧羰基保護的氨基酸與二異丙基乙基胺或9-芴甲氧羰基保護的氨基酸與縮合劑，于10～45℃反應(yīng)15～60min；抽干，加入封閉試劑反應(yīng)15～30min以封閉未反應(yīng)的基團，以N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌樹脂數(shù)次，加入脫除試劑脫除9-芴甲氧羰基保護的氨基酸上的9-芴甲氧羰基保護基，洗滌后加入接肽試劑進行接肽反應(yīng)，得到肽樹脂鏈，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾、羧基端連接樹脂如下序列：SEQ?ID?No:3、SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:5、SEQ?ID?No:6；

步驟3、將步驟2所得肽樹脂鏈加入到稀酸或弱酸溶液中，于10～45℃反應(yīng)60～90min，加入2,4,6-三甲基吡啶或二異丙基乙基胺中和，過濾；濾液濃縮，加入醇類、醚類或烷類溶劑析出固體保護肽，過濾收集濾餅真空干燥得到肽段，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的如下序列：SEQ?ID?No:3、SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:5、SEQ?ID?No:6；

步驟4、將4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基樹脂置于二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中30～60min，充分溶脹，溶脹樹脂溶液中樹脂的濃度為0.05～0.2g/ml；

步驟5、向步驟4所得溶脹樹脂溶液中加入脫除試劑，于10～45℃反應(yīng)15～30min，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌數(shù)次，加入接肽試劑，連接第一個氨基酸到樹脂上，于10～45℃反應(yīng)0.5～3.0h，抽干，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌樹脂數(shù)次，再加入脫除試劑進行脫除反應(yīng)脫除9-芴甲氧羰基，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌后加入9-芴甲氧羰基保護的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙基胺的接肽試劑全溶物進行接肽反應(yīng)，得到肽樹脂，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾、羧基端連接樹脂的SEQ?ID?No:2；

步驟6、將步驟5所得肽樹脂用溶脹劑溶脹后，加入脫除試劑脫除9-芴甲氧羰基，于10～45℃反應(yīng)15～30min，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌數(shù)次，依次加入氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ?ID?No:3、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ?ID?No:4、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ?ID?No:5、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ?ID?No:6、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；于10～45℃反應(yīng)0.5～3.0h，抽干；每加入一個肽鏈都要用N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌肽樹脂數(shù)次；加入脫除試劑脫除保護基，得到全保護肽樹脂，即羧基末端連接樹脂的依次包括SEQ?ID?No:6、SEQ?ID?No:5、SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:3和SEQ?ID?No:2的序列；

步驟7、向步驟6所得全保護肽樹脂中加入T輔助細胞表位、縮合劑的全溶物，于10～45℃反應(yīng)0.5～6.0h，抽干，依次用二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲醇洗滌樹脂數(shù)次得到全保護的抗原肽2600樹脂，即氨基端經(jīng)T輔助細胞表位修飾、羧基末端連接樹脂的依次包括SEQ?ID?No:6、SEQ?ID?No:5、SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:3和SEQ?ID?No:2的序列；

步驟8、將預(yù)冷至-10～10℃的切斷液加入到步驟7所得的抗原肽2600樹脂中切除所有保護基團及樹脂，于10～45℃反應(yīng)1～4h，過濾；濃縮濾液后加入甲基叔丁基醚析出沉淀，用甲基叔丁基醚洗滌沉淀數(shù)次后干燥得到未環(huán)化的抗原肽2600粗品，即氨基端經(jīng)T輔助細胞表位修飾的SEQ?ID?No:1；

步驟9、將步驟8所得抗原肽2600粗品溶于二甲亞砜水溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.0～8.0的條件下進行完全環(huán)化，即得環(huán)化合成肽抗原2600。