[發明專利]一種通過miR?200b調控GSK?3表達的方法及應用

有效

• 申請號: 201410568056.7
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104371978B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 崔紅;馬東青;楊麗君;楊愛君;朱琳涵
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京友誼醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 叢芳

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種GSK-3表達的方法及應用，更具體的，涉及通過miR-200b調控GSK-3表達的方法及應用。

背景技術

糖原合成酶激酶-3(Glyeogensynthasekinase-3，GSK-3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSK-3主要有2種亞型：GSK-3α和GSK-3β，其中GSK-3β是細胞內多種信號轉導通路的重要成分，尤其與細胞凋亡的發生關系密切。很少有酶能夠像GSK3一樣擁有廣泛的細胞調節影響力，它擁有超過四十種的蛋白可以被GSK3磷酸化，從如此眾多的可能底物中可以看出GSK3影響細胞功能的巨大潛力。PI3K/Akt信號轉導通路可以影響GSK-3β活性，激活的Akt通過磷酸化GSK-3β，從而抑制GSK-3β的活性。GSK-3β可進一步激活Bax、Bcl-2家族成員MCL-1(Myeloidcellleukemia-1，髓細胞淋巴瘤-1)，調控線粒體通透轉運孔MPTP的開放和關閉，調節線粒體內多種凋亡相關蛋白的釋放，如Bcl-2可調控線粒體通透轉運，維持線粒體內膜電位，阻止MPTP開放，抑制細胞色素C及凋亡誘導因子釋放，致使caspase-9、caspase-3激活最終引起細胞凋亡。在腦缺血損傷的研究中，糖原合成酶激酶-3β參與缺血對腦組織的損傷病理過程。體外和在體研究均發現特異性GSK-3β抑制劑氯化鋰可以保護神經細胞，抑制由多種原因所引起的神經細胞凋亡。

MicroRNAs是一類內源性表達的長約21-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，在真核生物中發揮基因表達調控作用。miRNAs以非完全互補的方式與靶mRNA的3’非編碼區(3'-untranslatedregion，3’-UTR)配對結合，從而引起翻譯抑制或靶mRNA降解。當前研宄表明，miRNAs參與調節生物體各種生命活動，包括細胞增殖，分化，調亡和遷移等。miRNA的異常表達與人類腫瘤發生發展密切相關，包括胃癌、肝癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌和膽管癌等。

本發明旨在研究在缺氧缺血性腦損傷的組織中調控GSK-3β的miR-200b。發明首先建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，進行相應組的miRNA激動劑或拮抗劑轉染，分別過表達和低表達miR-200b，于不同時間點取大鼠腦組織進行Western blot試驗，檢測GSK-3β蛋白的變化趨勢，從而了解miR-200b對GSK-3β的作用。結果顯示在缺氧缺血性腦損傷的組織過表達miR-200b時GSK-3β蛋白表達明顯升高，低表達miR-200b時GSK-3β蛋白表達有所下降。說明miR-200b在缺氧缺血性腦損傷的組織中能夠有效調控GSK-3β蛋白表達。這對缺氧缺血性腦損傷的修復具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抑制GSK-3β蛋白表達的方法，包括：

1)制備miRNA-200b模擬物和/或抑制劑；

2)將上步制備的miRNA施用到表達GSK-3β蛋白的細胞或組織中。

所述miRNA-200b成熟序列為mmu-mir-200b-3p(miRBase登錄號為MIMAT0000233)。

miRNA模擬物(miRNA mimics)已經成為研究基因調控的工具之一。miRNA mimics是一種RNA分子，可以通過載體導入細胞內，上調miRNA在細胞內或者活體內miRNA濃度，從而調控基因表達。開發的miRNA mimics有兩種，一種是前體分子60堿基以上的前體；一種是雙鏈的成熟體分子。這兩種分子都已經證實，能夠很好的上調miRNA在細胞內的豐度。

miRNA抑制劑(miRNA inhibitor)是運用化學方法合成的miRNA抑制劑，可通過與成熟miRNA分子特異性結合而抑制miRNA作用，可以削弱細胞中內源性miRNA導致的基因調控作用。

進一步，所述的細胞或組織為缺氧缺血性腦損傷的細胞或組織。

進一步，所述miRNA-200b選自其pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或變體的一種或幾種。

本發明中miRNA-200b、miR-200b、microRNA-200b屬于同一物質的不同表達形式，所代表的意思相同。