[發明專利]10-去氧碳代熒光素二乙酰脂熒光探針及其應用

無效

• 申請號: 201410564906.6
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104327844A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 彭若谷;伍誼波;第五振軍;徐晗;馬里杰
• 申請（專利權）人: 天津百螢生物科技有限公司
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D307/94;G01N21/64
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測細胞活性的熒光探針及其應用。

背景技術

藥物、環境污染、溫度、離子應激、放射污染或其他生物調節和潛在的不利因素都會對細胞或機體組織產生損害。細胞活性、細胞毒性測定在評價細胞或組織因上述原因導致的細胞改變時非常重要，細胞膜的完整性被廣泛的用于細胞活性測定，保護細胞的細胞膜的丟失導致細胞結構、胞漿物質、細胞離子梯度和膜電位等的喪失，細胞膜完整性的丟失將不可避免的導致細胞死亡。

在細胞膜完整性和細胞活性之間沒有等價的量化關系，一般情況下把擁有完整細胞膜的細胞歸為“活細胞”，而把因有毒的細胞試劑導致的細胞膜不可逆損傷的細胞歸為“死細胞”。當然有些細胞在死去的過程中還擁有細胞膜，這些是“將死細胞”，“將死細胞”實際上不是活細胞，它們不能繼續被培養和傳代，但是按照通常依賴于觀測細胞膜的方法經常把“將死細胞”計為活細胞。

細胞膜失去完整性的一個共同特征是其允許極性小分子（分子量小于2000道爾頓）進出細胞質。細胞膜通透性的改變是很多細胞活性、細胞毒性評價方法的基礎。最常用的用于檢測細胞活性/細胞毒性的方法是放射性的鉻⁵¹(⁵¹Cr)釋放和非熒光的臺盼藍有色染料排出。熒光染料比普通有色染料有更高的檢測靈敏度，也不需要如放射性元素那樣要求有復雜的材料處理過程。可是，現存的熒光素二乙酰脂熒光探針激發和發射波長都很短，容易受到細胞背景熒光干擾。例如，由于GFP（綠色熒光蛋白）的發射光譜與熒光素的發射光譜完全重疊，現存的熒光素二乙酰脂熒光探針不可能被用于測定GFP細胞的活性。然而，由于它們長波長發射本發明的10-去氧碳代熒光素二乙酰脂熒光探針則可被用于檢測GFP細胞的活性。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種簡便快速檢測細胞活性的熒光探針。10-去氧碳代熒光素二乙酰脂（I）在中性pH水溶液中有非常好的可溶性和穩定性。10-去氧碳代熒光素二乙酰脂相對無色、沒有熒光和具有很小的消光系數，然而,活細胞中脂酶可使10-去氧碳代熒光素二乙酰脂的雙脂鍵斷裂釋放出10-去氧碳代熒光素（II）使溶液熒光和消光系數急速變強，可達10000倍以上。

為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容：

一種具有如下結構式的熒光探針：

（I）

R₁和R₂分別是H、COOH或COOCH₂OAc。

優選R₁是H；R₂是COOCH₂OAc或COOH。

優選R₁是COOH，或COOCH₂OAc；R₂是H。

本發明進一步公開了熒光探針的合成方法，其特征在于按如下的步驟進行：:

（1）合成帶有保護基的蒽酮衍生物；

???

（2）蒽酮衍生物與溴代苯衍生物縮合給出10-去氧碳代熒光素；

?

(3)10-去氧碳代熒光素乙酰化給出10-去氧碳代熒光素二乙酰脂；

?

其中的R₁和R₂分別是H或COOH；

(4)10-去氧碳代熒光素二乙酰脂進一步脂化給出10-去氧碳代熒光素二乙酰脂羧酸脂;?

?

其中的R₁和R₂分別是H或COOCH2OAc。

本發明所述的步驟(2)中蒽酮衍生物與溴代苯衍生物的摩爾比為1比1~1.5，優選為1:1.25。

本發明更進一步公開了熒光探針在制備作為檢測細胞活性、細胞毒性熒光探針中的應用。實驗的結果表明采用本發明的熒光探針可以達到-降低細胞自身熒光干擾，使檢測結果更加準確的目的。

結構（I）無色、無熒光；結構（II）紅色、強烈紅色熒光。這種無色、無熒光的10-去氧碳代熒光素二乙酰脂是一種具有很好的光譜屬性的不發熒光的底物。10-去氧碳代熒光素二乙酰脂具有一個高反應性雙脂離去基團。另外活細胞中脂酶與10-去氧碳代熒光素二乙酰脂作用形成的10-去氧碳代熒光素產物（II）具有很好的穩定性。合成10-去氧碳代熒光素二乙酰脂需要經過四個步驟（見圖1和圖2）。

附圖說明