[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)曲酸的米曲霉菌株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410564556.3
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN104531536A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊海泉;華珊;宋江寧;王一恬;沈微;陳獻忠;樊游
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/06;C12R1/69
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株米曲霉菌株及其應(yīng)用，特別是一株高產(chǎn)曲酸的米曲霉菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在人體中，酪氨酸酶能催化酪氨酸與氧自由基經(jīng)復(fù)雜氧化、聚合，最后合成黑色素。曲酸及其衍生物能通過抑制酪氨酸酶的活性而抑制黑色素形成，而且安全無毒，因而在化妝品和食品防腐保鮮等領(lǐng)域具有廣泛的用途。在醫(yī)藥上，曲酸可以作為生產(chǎn)頭孢類抗生素的中間體。同時，可作為合成香料中間體、殺蟲劑原料等，在食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用前景。許多曲霉如米曲霉、黃曲霉、疏展曲霉、構(gòu)巢曲霉、寄生曲霉、白曲霉、煙曲霉、巨大曲霉、灰綠曲霉等和少數(shù)青霉，如產(chǎn)曲酸青霉等，能代謝產(chǎn)生曲酸。目前，生產(chǎn)中普遍使用的是米曲霉和不產(chǎn)生黃曲霉素的黃曲霉。1998年，周衛(wèi)東等人報道米曲霉2336培養(yǎng)6.5d后產(chǎn)曲酸7.45g/L(周衛(wèi)東，沈育芬，陳移亮，等.曲酸生產(chǎn)菌的誘變選育[J].亞熱帶植物通訊，1998，02：12-6)。沈衛(wèi)榮等于2003年報道誘變前黃曲霉C-527的曲酸產(chǎn)量為9.26g/L(沈衛(wèi)榮，沈儉，韓麗萍，等.曲酸生產(chǎn)菌的復(fù)合誘變選育[J].微生物學(xué)通報，2003，04：60-64)。2006年李一婧等人于2006年報道米曲霉QA96.8在誘變前曲酸產(chǎn)量為4.79g/L，即使經(jīng)多次紫外誘變后，曲酸產(chǎn)量僅上升至18.13g/L(李一婧，馬偉超.曲酸生產(chǎn)菌種的篩選和發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2006，06：42-44)。沈育芬等在2001年用米曲霉2336經(jīng)紫外線誘變篩選到一株突變株，曲酸產(chǎn)量達到26.36g/L(沈育芬，陳移亮，周衛(wèi)東，等.曲酸產(chǎn)生菌F31012變株的選育及發(fā)酵條件的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2001，02：73-77)。因此，篩選曲酸高產(chǎn)優(yōu)良菌株具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一株米曲霉菌株(Aspergillus?oryzae?QS)，已于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC?M?2014436，保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

所述產(chǎn)曲酸米曲霉從土壤中篩選得到，其保藏條件如下：用無菌蒸餾水將斜面上的孢子洗出，玻璃珠打散后用帶脫脂棉漏斗過濾制備孢子懸浮液。每個甘油管里面加入0.5mL孢子懸浮液和0.5mL?30％甘油，放入-70℃低溫冰箱保存。

固態(tài)平板培養(yǎng)基為(w/v)：5％葡萄糖，1％玉米淀粉，0.5％酵母膏，0.5％KH₂PO₄，0.25％MgSO₄·7H₂O，瓊脂粉2％，自然pH，滅菌。

液體種子培養(yǎng)基為(w/v)：10％葡萄糖，2％玉米淀粉，1％酵母膏，0.5％KH₂PO₄，0.25％MgSO4·7H₂O，用稀HCl調(diào)pH至4.0，滅菌。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v)：12％葡萄糖，1.0％豆餅粉，0.3％酵母膏，0.2％KH₂PO₄，0.02％MgSO₄·7H₂O，自然pH，滅菌。

米曲霉的培養(yǎng)條件為：將已保藏甘油管的米曲霉孢子在固體平板培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)5d后將孢子接入液體種子培養(yǎng)基，30℃，200rpm，搖床培養(yǎng)27h。以10％(v/v)的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接種到發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，30℃，200rpm，搖床培養(yǎng)。

將產(chǎn)曲酸米曲霉發(fā)酵后的發(fā)酵液，10000rpm離心2min，采用三氯化鐵比色法測定離心后發(fā)酵上清液的曲酸產(chǎn)量。在發(fā)酵2d后開始生產(chǎn)曲酸，7d后曲酸產(chǎn)量可達25g/L。

本發(fā)明自土壤中篩選出一株產(chǎn)曲酸米曲霉，是一株曲酸產(chǎn)量較高的野生菌株。該菌株生產(chǎn)的曲酸可廣泛應(yīng)用于食品防腐保鮮、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等行業(yè)，具有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

附圖說明：

圖1：曲酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2：米曲霉篩選顏色反應(yīng)及菌落形態(tài)

圖3：曲酸發(fā)酵生產(chǎn)

具體實施方式：

實施例1：三氯化鐵測定曲酸含量方法

曲酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

1)0.1％曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取曲酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g于100mL容量瓶中，加入適量蒸餾水使之完全溶解，并用蒸餾水定容至100mL，得到1mg/mL的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。