[發(fā)明專利]一種產(chǎn)阿維菌素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410562842.6
• 申請(qǐng)日: 2014-10-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105586284A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 儲(chǔ)炬;宋曉清;譚俊;王永紅;莊英萍;張嗣良;郭元昕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海國(guó)佳生化工程技術(shù)研究中心有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N15/01;C12R1/465
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)阿維菌素高產(chǎn)菌 的高通量篩選方法。

背景技術(shù)

阿維菌素(Avermectin，AVM)是由日本靜岡土壤放線菌——阿維鏈霉菌 (Streptomycesavermitilis)產(chǎn)生的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有廣泛的 殺蟲(chóng)和抗寄生蟲(chóng)等生物活性，主要用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和禽畜寄生蟲(chóng)的防治，在我 國(guó)農(nóng)業(yè)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。美國(guó)默克公司又通過(guò)對(duì)阿維菌素結(jié)構(gòu) 的改造，得到兩個(gè)新品種的農(nóng)藥——伊維菌素和埃瑪菌素。2011年，阿維菌 素全球銷售額達(dá)到3.35億美元，我國(guó)市場(chǎng)年產(chǎn)量為3500噸左右。中國(guó)國(guó)內(nèi)注 冊(cè)生產(chǎn)阿維菌素的公司有十多家，發(fā)酵周期為240h左右，但是阿維菌素的效 價(jià)不高，為4000μg/ml左右。這對(duì)產(chǎn)阿維菌素菌株的誘變篩選提出了要求。

從當(dāng)前我國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)來(lái)看，目前我國(guó)高產(chǎn)的工業(yè)生產(chǎn)菌種的獲得主 要還是采用隨機(jī)選育，包括自然選育、誘變育種和以原生質(zhì)體融合為代表的 雜交育種技術(shù)，篩選工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。這是因?yàn)楫a(chǎn)量性狀受多基因決定， 一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需要多輪誘變篩選才能獲得穩(wěn)定、高產(chǎn) 的單菌落培養(yǎng)物(菌株)，每輪都是一個(gè)大量篩選的過(guò)程，這一點(diǎn)不同于以發(fā)現(xiàn) 化合物為目標(biāo)的菌種篩選。因此，擴(kuò)大篩選量可以有效減少隨機(jī)篩選的盲目 性特點(diǎn)，是提高育種效率的一個(gè)重要方面，可以說(shuō)篩選是菌種選育過(guò)程成敗 的一個(gè)關(guān)鍵步驟，但無(wú)論是隨機(jī)篩選還是推理選育，都受到人力物力等諸多 因素的限制，使得篩選效率很低，勢(shì)必造成漏篩。因此，需要建立新的篩選 方法以提高篩選效率。

近幾年用于微生物菌種高通量篩選裝置及其相關(guān)技術(shù)不斷發(fā)展和成熟。 特別是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)發(fā)出全自動(dòng)高通量篩選工作站，應(yīng)用最先進(jìn)的計(jì)算 機(jī)技術(shù)和機(jī)器人技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)高效高通量篩選，但是此類大型設(shè)備價(jià)格相 當(dāng)昂貴，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家，也只有財(cái)力雄厚的大型實(shí)驗(yàn)室具備購(gòu)買(mǎi)能力，國(guó) 內(nèi)企業(yè)近期內(nèi)根本無(wú)法承受。因此，使用現(xiàn)有的通用低成本儀器設(shè)備，自主 開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快速、精準(zhǔn)、高效的高通量篩選技術(shù)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)阿維菌素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種高通量篩選阿維菌素高產(chǎn)菌的方法，包括：

(1)將待篩選的阿維菌素生產(chǎn)菌分別接種于深孔板中，在孔板發(fā)酵培養(yǎng)基 中培養(yǎng)使其生產(chǎn)阿維菌素；其中，所述的孔板發(fā)酵培養(yǎng)基包括：玉米淀粉7±1 g/L、豆餅粉1.25±0.2g/L、酵母粉0.5±0.08g/L、硫酸銨0.0125±0.002g/L、碳 酸鈣0.04±0.006g/L、氯化鈷0.0011±0.0002g/L、鉬酸鈉0.0011±0.0002g/L、硫 酸錳0.00011±0.000025g/L、淀粉酶0.005±0.0008g/L；

(2)采用比濁法檢測(cè)深孔板各孔的阿維菌素的產(chǎn)量，鑒定阿維菌素高產(chǎn)菌。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的待篩選的阿維菌素生產(chǎn)菌是經(jīng)誘變處理的菌株。

在另一優(yōu)選例中，所述的誘變處理包括：以阿維菌素生產(chǎn)菌為出發(fā)菌進(jìn)行 誘變，獲得經(jīng)誘變的菌株。

在另一優(yōu)選例中，獲得經(jīng)誘變的菌株后，還包括：在經(jīng)誘變的菌株(較佳地， 還進(jìn)行平板培養(yǎng))中，挑選單克隆分別轉(zhuǎn)接于種子深孔板各孔中進(jìn)行培養(yǎng)(每孔 一個(gè)克隆)，之后分別轉(zhuǎn)接于發(fā)酵深孔板各孔(每孔一個(gè)克隆)中。

在另一優(yōu)選例中，所述的孔板發(fā)酵培養(yǎng)基的pH7.5±0.2。

在另一優(yōu)選例中，所述的深孔板為24孔、48孔或96孔深孔板。

在另一優(yōu)選例中，所述的深孔板為24孔的方形深孔板，每孔裝液體積為 1.4-1.8ml(最佳地為1.6ml)，發(fā)酵培養(yǎng)接種量是5％，搖床轉(zhuǎn)速250±20rpm，培 養(yǎng)溫度28±1℃；種子培養(yǎng)42±4小時(shí)，發(fā)酵周期240±20小時(shí)。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)深孔板各孔的阿維菌素的產(chǎn) 量。