[發明專利]高純度替考拉寧精粉的純化方法

在審

• 申請號: 201410562794.0
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN104371011A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 陳麗;連云陽;羅婷;江寧宇;彭飛;王傳喜
• 申請（專利權）人: 福建省微生物研究所
• 主分類號: C07K9/00
• 分類號: C07K9/00;C07K1/20
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 林曉琴

1.一種高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)將替考拉寧發酵液離心除去發酵液中的固體，得到含替考拉寧的濾液；

(2)將所述濾液進行大孔吸附樹脂柱層析，先采用純水以10L/h的流速洗脫，再用體積比10:90，15:85，20:80，25:75，70:30的丙酮-水溶劑系統以12L/h的流速進行梯度洗脫，收集以70％丙酮水溶液為洗脫劑的洗脫液，并濃縮，得到濃縮物；

(3)將所述濃縮物經過凝膠層析柱過濾，先用體積比10:90或15:85的甲醇-水洗脫；再用體積比35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液進行洗脫；收集以35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液為洗脫劑的洗脫液，濃縮以獲得濃縮液；

(4)往濃縮液中加入丙酮沉淀30min，得替考拉寧粗品；用水溶解替考拉寧粗品，并加樣至反相硅膠層析柱進行層析，先用15％乙腈水溶液洗脫2h，再用30％乙腈水溶液洗脫1.5h，最后用46％乙腈水溶液洗脫，分段收集，通過HPLC檢測各段洗脫液中替考拉寧各組分的純度，將滿足純度要求的洗脫液合并；

(5)往洗脫液中加入1.5～2.5％(w/v)的活性炭脫色20min，過濾，冷卻沉淀除去雜質，加入6倍于上清液體積的丙酮于上清液中沉淀，低溫結晶得晶體，晶體經紅外干燥，得到替考拉寧純品。

2.如權利要求1所述的高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：所述(1)的具體操作方法如下：

將替考拉寧發酵液調pH至11.0，室溫保持15min，再回調至PH7.5，然后4500rpm離心10min，取上清液稀釋至2倍體積。

3.如權利要求1所述的高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：所述大孔吸附樹脂為HP20樹脂、D3520樹脂、HZ816樹脂或AB-8樹脂。

4.如權利要求1所述的高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：所述(3)中的凝膠層析柱是指葡聚糖凝膠層析柱或瓊脂糖凝膠層析柱。

5.如權利要求1所述的高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：所述(4)中的反相硅膠層析柱為C8反相硅膠層析柱或C18反相硅膠層析柱。

6.如權利要求1所述的高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：

所述(4)中，所述46％乙腈水溶液中含有3.15g/L的NaH₂PO₄，pH為6.5，且采用磷酸調節pH；所述15％、30％乙腈水溶液中均含有4.10g/L的NaH₂PO₄，pH為6.5，且采用磷酸調節pH。

7.如權利要求1所述的高純度替考拉寧精粉的純化方法，其特征在于：所述(4)中的通過HPLC檢測各段洗脫液中替考拉寧的純度，其具體操作方法如下：

色譜柱為Ultimate?Welch-C18；色譜柱規格是5μm、250mm×4.6mm；流動相A為體積比900:100的3g/L?NaH₂PO₄-乙腈，流動相B為體積比300:700的3g/L?NaH₂PO₄-乙腈；采用流動相A和流動相B進行梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm，進樣量為10μL；其中，流動相A和流動相B按下述比例梯度洗脫：