[發明專利]一種人源溶菌酶蛋白純化方法

有效

• 申請號: 201410562496.1
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN105586327B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 江松敏;余龍;余文博;于穎;曹立環;陶建軍;唐麗莎;楊鮮梅;賽音
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種人源溶菌酶蛋白純化方法，其特征在于，該人源溶菌酶蛋白純化方法包括以下步驟：

1)發酵液的前處理，包括去除人溶菌酶溶液中的固體雜質和調整酸堿度，將含重組人源溶菌酶的發酵液調pH至6.5；去除雜質時，先將溶液離心，收集上清，然后使用中空纖維超濾膜處理上清液，進一步除去樣品中的小顆粒物質；

2)Bestarose MMC Diamond捕獲，加入Bestarose MMC Diamond洗脫緩沖液B，調節樣品電導使其與平衡緩沖液A電導一致，達到43ms/cm,即為Bestarose MMC Diamond柱上樣原樣，Bestarose MMC Diamond捕獲需要根據目標產品的理化性質，選擇合適的色譜條件，用陽離子交換介質作為人溶菌酶的純化介質,采用的層析柱和緩沖液的條件如下：

層析柱：BXK 50/30，Vt＝300mL；

平衡緩沖液A：0.4M NaCl，20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.5；

洗脫緩沖液B：1.5M NaCl，20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.5；

平衡緩沖液A平衡5個柱體積，至層析柱流出液的pH、電導與平衡緩沖液一致，將上述處理后的上樣原樣以30mL/min流速上樣，上樣結束后用平衡緩沖液A清洗3～5個柱體積直到基線穩定，即所有未結合的物質都被沖洗出分離柱，然后用洗脫緩沖液B洗脫目的蛋白，根據UV280洗脫峰收集樣品；

3)Bestdex G-25緩沖液置換，濃縮前對樣品進行緩沖液置換，使其電導小于10ms/cm，采用的層析柱和緩沖液的條件如下：

層析柱：BXK 200/500，Vt＝5L；

平衡緩沖液：20mM NaAC，pH4.75；

平衡緩沖液平衡2 個柱體積，至層析柱流出液的pH、電導與平衡緩沖液一致，將Bestarose MMC Diamond 洗脫樣品以200mL/min 流速上樣，上樣體積小于1.5L，上樣結束后繼續用平衡緩沖液清洗，根據UV280 峰收集樣品；

4)濃縮目的蛋白，采用SP Bestarose FF柱進行樣品濃縮，采用SP Bestarose FF柱進行樣品濃縮的步驟包括：平衡緩沖液平衡3～5個柱體積，至層析柱流出液的pH、電導與平衡緩沖液一致，將置換過緩沖液的樣品以20mL/min流速上樣，上樣結束后用平衡緩沖液清洗3～5個柱體積直到基線穩定，即所有未結合的物質都被沖洗出分離柱，然后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，根據UV280洗脫峰收集樣品，采用的層析柱和緩沖液的條件如下：

層析柱：BXK 50/30，Vt＝280mL；

平衡緩沖液：20mM醋酸鈉，pH4.75；

洗脫緩沖液：0.15M NaCl，20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5。

2.根據權利要求1所述的人源溶菌酶蛋白純化方法，其特征在于，含有人溶菌酶溶液直接采用人溶菌酶溶液的發酵液。