[發明專利]一種用于檢測諾卡氏菌的核苷酸序列及應用

無效

• 申請號: 201410562243.4
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN104263844A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 李振軍;孫渭歌
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

技術領域

本發明涉及TaqMan探針在細菌檢測中的應用，特別是諾卡氏菌鑒別診斷中的應用，屬于分子生物學和微生物學領域。

背景技術

諾卡氏菌(Nocardiaceae)是一種需氧的革蘭氏陽性棒狀桿菌，1890年Eppinger報道了由諾卡菌引起的第一例人類感染病例，它引起的諾卡菌病是一種急性或慢性化膿性或肉芽腫性的病變。免疫力低下的人群最易感染，主要引起肺部疾病、皮膚性疾病以及全身播散性疾病，臨床病癥復雜多樣，主要有菌血癥、積膿癥、心包炎、感染性心內膜炎等，嚴重時甚至能夠引起病人的死亡。諾卡氏菌是條件致病菌，內源性感染的幾率較小，很少發生人傳人的現象。根據國內外的報道，目前至少有6種諾卡氏菌能夠同時感染人與動物，研究學者通過大量的調查研究發現諾卡氏菌病的感染幾率正在逐年增加，而且諾卡氏菌經常會侵襲腦部，形成膿腫，造成致死性感染，傳統的鑒定諾卡氏菌的方法如分離培養、表型鑒定等較為費時費力，易延誤病情，難以滿足目前的臨床診斷需求。

實時熒光TaqMan?PCR技術(real?time?TaqMan?PCR，TaqMan是羅氏公司(Roche?Molecular?System,Inc.)的注冊商標)最近幾年廣泛應用于病原體微生物的檢測，普通PCR方法只能將產物從大小上進行區分，實時熒光TaqMan?PCR技術在普通PCR的基礎上又加入一條特異的熒光探針，并且該技術對引物與模板的同源性要求也高于普通PCR。實時熒光TaqMan?PCR中的探針序列必須與目標序列完全匹配，熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；但在PCR擴增時，隨著引物的延伸Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特異性。但是在熒光TaqMan?PCR技術的應用中，探針的選擇是一個重要因素，因為其涉及到與引物的匹配，以及最關鍵的檢測特異性的問題。本發明旨在應用實時熒光TaqManPCR技術，建立一種針對諾卡氏菌的靈敏、特異、快速的核酸檢測體系，用于模臨床標本的檢測

發明內容

本發明的目的在于提供一種應用能夠應用于細菌檢測，特別是熒光TaqMan?PCR技術的檢測探針序列，更進一步提供于熒光TaqMan?PCR技術檢測諾卡氏菌方法，以及用于該方法的試劑盒。

基于上述目的，本發明首先提供了一種用于細菌檢測的探針序列，所述序列含有如SEQ?ID?NO:3所示的序列。

其次，本發明提供了一種用于非診斷目的的熒光TaqMan?PCR檢測方法，所述方法包括：

(1)被檢測物種的基因組DNA的抽提；

(2)以步驟(1)獲得的DNA為模板進行TaqMan?PCR擴增，其中上游引物為SEQ?ID?NO:1所示的序列，下游引物為SEQ?ID?NO:2所示的序列，探針序列為SEQ?ID?NO:3所示的序列；

(3)對擴增結果進行檢測分析。

在本發明一個優選實施方案中，所述步驟(2)的PCR反應條件為：

在另一個優選實施方案中，所述步驟(2)和(3)在ABI7500Fast實時熒光定量PCR儀中進行。

優選地，所述物種為細菌。

更為優選地，所述細菌選自下述細菌：諾卡氏菌、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯、肺炎鏈球菌、百日咳桿菌、分枝桿菌、小腸耶爾森菌、艱難梭菌。

最為優選地，所述細菌為諾卡氏菌。

本發明提供的檢測方法的結果判斷方法為：(1)若樣品有明顯的S型擴增，且Ct值≤34，則判定樣品為諾卡氏菌陽性；(2)若有S型擴增，且34<Ct≤40，判定為不確定樣品，需重新提取核酸檢測；若復檢的樣品仍有S型擴增，且Ct<40，則判定為諾卡氏菌陽性，否則為陰性；(3)若無明顯的S型擴增曲線，但報告仍有熒光值、Ct值，為非特異性擴增，可能為探針降解所釋放的非特異性熒光信號。

最后，本發明還提供了一種用于細菌檢測的TaqMan?PCR試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)熱啟動Taq?DNA聚合酶；

(2)實時熒光定量PCR緩沖液；

(3)序列為SEQ?ID?NO:1的上游引物為和序列為SEQ?ID?NO:2的下游引物；

(4)序列為SEQ?ID?NO:3的探針。