[發明專利]一組核苷酸序列及在單增李斯特菌鑒定中的應用

有效

• 申請號: 201410561801.5
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN104328113A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 王毅;王艷;葉長蕓
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

技術領域

本發明涉及交叉恒溫擴增在細菌檢測中的應用，特別是在單增李斯特菌鑒別診斷中的應用，屬于分子生物學和微生物學領域。?

背景技術

單增李斯特菌(Listeria?monocytogens，LM)是廣泛存在于環境中的革蘭氏陽性、有運動能力、兼性胞內寄生短桿菌，是重要的食源性人獸共患病原菌，能夠引起人類嚴重感染。李斯特菌病的易感人群主要為免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生兒和孕婦；后者為腫瘤患者、艾滋病患者和器官移植受體等。人類李斯特菌病主要臨床癥狀為敗血癥、腦膜炎、孕婦流產、死產以及發熱性胃腸炎等，該菌可穿越腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障。單增李斯特菌病在人類的感染率不高，但該病的死亡率極高而受到廣泛的關注，一度成為歐美國家重大公共衛生問題。國內尚無由單增李斯特菌引起食物中毒暴發的報道，實際存在與否不明，散發病例在多個省市都有報道。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療和單增李斯特菌的流行病學調查，研發一個省時、省力和特異性較高的單增李斯特菌檢測方法成為必要。?

目前對于單增李斯特菌分離鑒定主要依賴于傳統的增菌培養和生化鑒定，該方法耗時大約5到7天，包括二次增菌，選擇培養及后續的生化鑒定，耗時耗力，生化結果的判讀依賴于人的主觀判斷，導致結果重復性差，易錯判。隨著核酸診斷技術的快速發展，一些以PCR為基礎的診斷技術(如普通PCR技術，熒光PCR技術)被用于單增李斯特菌的快速診斷，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續的電泳操作，較高的探針合成費用，以及熟練的操作人員。一些基層實驗室無法開展，限制了這些技術的運用。目前運用這些檢測技術診斷單增李斯特菌的PCR方法和real-time?PCR方法，所選擇的目的基因(如hly，prfA，iap)?特異性差，極易出現假陽性擴增。此外PCR檢測技術的靈敏度差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。隨著恒溫技術的出現，環介導恒溫擴增技術(LAMP)已經被用于單增李斯特菌的檢測，然而該技術的引物設計復雜，對目的基因的保守性要求較高，目前報道的診斷單增李斯特菌的LAMP技術主要根據hly和prfA基因設計引物，然而這些基因的特異性差，容易導致假陽性擴增，不利于單增李斯特菌的準確診斷。因而，急需發展一種簡單、快速、靈敏和特異的診斷技術用于單增李斯特菌檢測。?

交叉恒溫擴增技術(Cross?priming?amplification,CPA)是由Xu?Gaolian等建立的一種新的恒溫核酸擴增技術，具有靈敏高、操作簡單、不依賴于昂貴設備、產物易檢測等優點。該技術已被廣泛用于分子診斷領域。CPA針對靶序列的5個特異部位設計7條引物，利用具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，靶序列能夠得以高效擴增。7條核心引物之中2條為交叉引物，即As和Sa；2條為置換引物，即4s和5a；3條為擴增引物，即3a、2a和1s。交叉引物As包含2a和1s，即5'-2a-1s；Sa包含1s和2a，即5'-1s-2a。?