[發明專利]一種通過三維熒光光譜優化超聲條件提取胞外聚合物的方法

在審

• 申請號: 201410559720.1
• 申請日: 2014-10-18
• 公開（公告）號: CN104316502A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 李夕耀;彭永臻;何岳蘭;張瓊;賈方旭
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本專利屬于污水生物處理活性污泥組分分析領域，具體涉及一種用熒光分光光度儀掃描超聲后提取活性污泥緊密胞外聚合物的過濾液，得到三維熒光光譜圖后，評價超聲細胞破碎及胞外聚合物提取程度的方法，最終選擇優化后的超聲條件提取污泥緊密胞外聚合物。

背景技術

在廢水生化處理中，活性污泥的胞外聚合物(Extracellular?Polymeric?Substances，EPS)是在特定廢水水質、處理工藝、反應裝置的運行條件下，微生物生長代謝中分泌、吸附、溶解的包覆在細胞外部的多聚物，包括蛋白質、多糖、腐殖酸等。

EPS在污水處理中有重要作用：相互黏附，保持細胞的絮體結構或者生物膜的聚集；提供活性污泥良好的保護屏障，抵御有毒物質及惡劣環境；保持菌膠團或者生物膜的水分，影響污泥沉降、過濾與脫水性能；含有大量的酶，參與廢水中污染物質的吸附與去除。所以，提取與分析活性污泥胞外聚合物的組成對指導污水生物處理有重要意義。根據EPS與污泥細胞結合的程度，分為松散附著型胞外聚合物(Loosely?Bound?Extracellular?Polymeric?Substances,LB-EPS)及緊密附著型胞外聚合物(Tightly?Bound?Extracellular?Polymeric?Substances,TB-EPS)。

分層提取活性污泥胞外聚合物的方法有多種，包括樹脂提取法、熱與堿提取法、梯度離心法和超聲提取法等。其中，離心與超聲提取無需加入其他化學試劑，操作簡單，經濟易行，且提取的EPS不需透析等處理即可測定，因而得到廣泛應用。

不同聲強、聲能密度、時間的超聲波作用于不同濃度的菌膠團活性污泥，可以破壞絮體結構、分散細胞，使得粘在細胞表面的物質脫落，提取緊密附著型胞外聚合物，例如各種酶(α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶等)。但是，超聲強度與能量增大時，將破碎細菌，釋放細胞內的營養物質。因此，判斷超聲過程中緊密附著型胞外聚合物是否提取完全及細胞是否破碎對分析活性污泥胞外聚合物十分關鍵。

發明內容

本發明的目的是在離心提取LB-EPS后，通過三維熒光光譜評價不同超聲條件下TB-EPS的提取情況。胞外聚合物中含有的物質不同，在不同激發和發射波長下有對應的熒光反應。本發明的方法依靠某類蛋白質物質為可溶性微生物產物，其平均熒光強度變化的特征，具有評價準確，分析快速的特點。

為了實現超聲提取緊密附著型胞外聚合物的目的，本發明采用以下方案：

取活性污泥混合液，在4℃以2000g的離心力離心15分鐘，得到細胞黏液Slime。將Slime倒去，加入磷酸鹽緩沖液至活性污泥混合液的原體積，在4℃以4000g的離心力離心15分鐘，上清液即為LB-EPS。再次加入PBS至原體積后，混合均勻，在不同強度和不同時間下超聲。離心或超聲后的水樣經0.45微米濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析測定。

三維熒光光譜掃描測定條件：采用氙弧燈為激發光源，激發波長200～450nm，發射掃描波長220～600nm，激發和發射狹縫寬度為5～15nm，激發波長掃描間隔為0.5～10nm，掃描速度為900～1500nm/min。

超聲樣品后的三維熒光光譜圖合成：用Wolfram?軟件將樣品的熒光強度減去同條件下蒸餾水的三維熒光值，合成3D-EEM圖。

優化不同超聲條件提取TB-EPS：將扣除空白后的激發波長260～280nm與發射波長360～375nm范圍內熒光數據進行平均，得到類蛋白質可溶性微生物產物平均熒光強度。以超聲強度和超聲時間為平面二維坐標，平均熒光強度為縱坐標，繪制三維立體關系圖。平均熒光強度突變時對應的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。

本發明的優點是：

1、評價方式簡單易行，不需要復雜的操作過程測定化學組分，僅依靠過濾后樣品的三維熒光光譜分析與計算過程。

2、靈敏度高，適用于不同超聲儀器和超聲條件下對污泥胞外聚合物提取程度及細胞破碎情況的評價。

3、超聲及判斷過程中樣品不添加其他物質，可以進行后續分析檢測，例如：測定蛋白質總量及沉淀后再溶解進行蛋白質雙向電泳，研究EPS蛋白質組學與污水處理工藝之間的聯系。

附圖說明

圖1活性污泥分層提取EPS

圖2緊密附著型胞外聚合物的熒光光譜圖

圖3超聲時間、超聲強度與平均熒光強度的關系

具體實施方式