[發明專利]一種原花青素誘導肝癌細胞自噬性死亡的分析方法及應用

在審

• 申請號: 201410555717.2
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104774909A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 段玉清;柯佳佳;張海暉;許慧;蔡梅紅;何遠清;馬海樂
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/68;G01N21/64;A61K31/353;A23L1/29;A61P35/00
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一種原花青素誘導肝癌細胞自噬性死亡的分析方法，其特征在于：包括，

原花青素對肝癌HepG2生長增殖的抑制作用的分析：

取對數生長期的HepG2細胞經胰蛋白酶消化，接種培養24h后，經原花青素處理6～120h，除去培養基并洗滌后，加入MTT孵育，結束后加入DMSO溶解，于酶標儀490nm處測定吸光度，計算生長抑制率；

CSPCs誘導HepG2細胞自噬的劑量效應和時間效應的分析：

標記自噬細胞，將HepG2細胞接種培養孵育24h后，用原花青素處理細胞不同時間或用雷帕霉素處理12h，實驗結束后孵育1h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察并熒光定量；

透射電鏡觀察自噬小體的分析：

收集各處理組的HepG2細胞，離心，棄上清，分別固定，然后脫水，超薄切片，乙酸雙氧鈾和檸檬鉛負染，于透射電鏡觀察并定量；

細胞的周期分析：

取對數生長期HepG2細胞接種孵育24h后，用原花青素處理細胞12h，或經預處理后用原花青素孵育，實驗結束后，加入碘化丙錠染色液避光染色，過濾后上流式細胞儀分析細胞DNA含量的變化；

細胞內高活性氧自由基分析：

細胞內高活性氧自由基含量采用氧化敏感探針，DCFH-DA進入細胞被高活性氧自由基氧化成有熒光2'7'-dichlorofluorescein，通過測定DCF熒光強度即能反映高活性氧自由基產生的量，將細胞分別用原花青素和陽性對照雷帕霉素孵育，隨后用原花青素孵育，細胞經DCFH-DA處理后，立即于熒光顯微鏡觀察并定量；

線粒體膜電位測定的分析：

線粒體膜電位測定采用親脂性熒光探針JC-1，在正常細胞內JC-1以聚合體的形式分布在線粒體內，在590nm處會激發出紅色熒光，表明高的膜電位，當線粒體膜電位下降，JC-1以單體形式與膜結合，在530nm處激發出綠色熒光，因此通過JC-1的紅光/綠光強度比可以判斷線粒體膜電位的變化，將HepG2細胞經原花青素處理12h，收獲細胞，洗滌，用含有JC-1的完全培養基于37℃孵育30min，直接于熒光顯微鏡下觀察并分析；

數據處理分析：

數據以X±SD表示，采用SPSS統計學軟件，進行t檢驗數據處理和方差分析，其中，—X代表平均值，SD代表標準偏差，t代表檢驗某個變量的總體均值和某指定值之間是否存在顯著性差異。

2.一種原花青素通過刺激活性氧誘導人肝癌細胞自噬性死亡在治療和預防肝癌方面的應用，其特征在于：原花青素低聚體結構式為：

其中，n＝2～4。

3.如權利要求2所述的原花青素通過刺激活性氧誘導人肝癌細胞自噬性死亡在治療和預防肝癌方面的應用，其特征在于：所述原花青素通過刺激肝癌HepG2細胞內產生高活性氧自由基誘導肝癌細胞發生自噬性死亡。

4.如權利要求3所述的原花青素通過刺激活性氧誘導人肝癌細胞自噬性死亡在治療和預防肝癌方面的應用，其特征在于：所述原花青素通過刺激肝癌HepG2細胞內產生高活性氧自由基誘導肝癌細胞發生自噬性死亡的過程中，肝癌細胞內的線粒體也參與了此過程。