[發(fā)明專利]家蠶鈉鉀ATP酶及其基因和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410555339.8
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104312993A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 趙萍;衣啟營;王鑫;夏慶友;宋倩茹
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/85
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 王貴君

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及家蠶鈉鉀ATP酶，還涉及編碼家蠶鈉鉀ATP酶的基因和應用。

背景技術

鈉鉀ATP酶(NKA)又叫鈉鉀泵，是由丹麥科學家J.C.Skou在1957年首次發(fā)現(xiàn)的P-type?ATP酶，它存在于大多數(shù)真核生物細胞中。細胞內外的鈉離子濃度梯度可以維持細胞的體積，而且可以通過Na⁺/H⁺和Na⁺/Ca²⁺交換體維持細胞內的氫和鈣離子濃度。此外，細胞內鈉離子梯度產生的靜電勢是很多細胞膜轉運過程(例如葡萄糖，氨基酸和其他營養(yǎng)物質向細胞內的轉運)的驅動力，而NKA的主要功能就是維持細胞內的高鉀和低鈉的離子濃度梯度。

迄今為止，在脊椎動物細胞中共發(fā)現(xiàn)四個NKA的同位體，除了具有離子轉運的功能外，脊椎動物的NKA的α1亞單位可與Src相互作用形成內源激素哇巴因(ouabain)的受體，進而介導細胞下游信號通路來調控細胞的生長速度，特別是在胚胎發(fā)育，神經導向，中樞神經系統(tǒng)發(fā)育等生理學過程中，發(fā)揮了重要作用。近年來許多非脊椎動物如果蠅、暗蚊、線蟲和水蛭等的鈉鉀ATP酶基因相繼被克隆出來，經過同源比對發(fā)現(xiàn)它們與脊椎動物的NKA同源性非常高，但對非脊椎動物NKA是否也可以與Src相互作用形成受體復合物的研究未見報道。作為鱗翅目昆蟲模式生物，家蠶的神經組織中存在NKA，但NKA基因在家蠶體內是以何種形式存在及該基因表達酶的活性包括對家蠶生長發(fā)育等過程的影響均未被研究，因此，對家蠶鈉鉀ATP酶(BmNKA)的全長基因進行克隆、表達和相關功能的研究將有利于闡明NKA在參與無脊椎動物發(fā)育、信號傳導等過程中所起的具體功能。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供家蠶鈉鉀ATP酶，本發(fā)明的目的之二在于提供編碼家蠶鈉鉀ATP酶的基因，本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述基因的表達載體；本發(fā)明的目的之四在于提供家蠶鈉鉀ATP酶的應用。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

1、家蠶鈉鉀ATP酶，所述家蠶鈉鉀ATP酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示或SEQ?ID?NO.8所示氨基酸序列經取代、缺失或添加至少一個氨基酸且來源于家蠶的具有鈉鉀ATP酶功能的酶。

2、編碼權利要求1所述家蠶鈉鉀ATP酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7第172-3021位所示或SEQ?ID?NO.7第172-3021位經取代、缺失或添加至少一個堿基且來源于家蠶的編碼具有鈉鉀ATP酶功能的核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

3、含有所述基因的表達載體。

優(yōu)選的，所述表達載體由SEQ?ID?NO.7第172-3201位所示核苷酸序列連入pEYFP-C1載體的BspEI和BamHI酶切位點處。

4、權利要求1所述家蠶鈉鉀ATP酶在改良蠶絲纖維性能中的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了家蠶鈉鉀ATP酶和編碼家蠶鈉鉀ATP酶的基因，家蠶鈉鉀ATP酶具有四個鈉、鉀離子及ATP結合的保守的氨基酸位點，屬于典型的P-type鈉鉀ATP酶，組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)家蠶鈉鉀ATP酶基因在五齡第3天的各個組織中均有表達，而在蛋白水平鈉鉀ATP酶只在家蠶五齡三天的頭部和表皮中有表達，將編碼家蠶鈉鉀ATP酶的基因構建重組表達載體在體外真核表達后具有水解ATP酶活性，建立單克隆細胞系是后續(xù)鈉鉀ATP酶在信號傳導功能研究良好的細胞模型，這為闡明家蠶鈉鉀ATP酶參與家蠶發(fā)育、信號傳導等過程具有重要意義，也為獲得一種絲纖維性能改良的新型家蠶品種具有重要意義。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1為BmNKA基因的結構注釋圖。

圖2為BmNKA基因和BmNKA蛋白在5齡第3天家蠶雌雄幼蟲中的組織表達特征(A：BmNKA基因組織表達譜；B：BmNKA蛋白Western檢測結果)。

圖3為建立的表達YFP-ratα1和YFP-Silkwormα兩個單克隆細胞系中外源大鼠與家蠶鈉鉀ATP酶和內源鈉鉀ATP酶的Western定量檢測結果(A和C表示外源鈉鉀ATP酶表達結果；B和D表示內源鈉鉀ATP酶表達結果)。