[發明專利]一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌

在審

• 申請號: 201410555019.2
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104293726A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;堵國成;金鵬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P19/26;C12R1/125
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種產小分子透明質酸的重組枯草芽孢桿菌，尤其是一種構建重組枯草芽孢桿菌發酵葡萄糖聯產透明質酸酶和小分子透明質酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

透明質酸(Hyaluronic?Acid，HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨特的分子結構和理化性質，使其具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發現的自然界中保濕性最好的物質，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用于化妝品、食品和醫藥等行業領域。近年來研究發現，低分子量的HA和透明質酸寡糖(低于1×10⁴)具有獨特的生物學功能。此外，HA寡糖容易被人體吸收而用于人體自身HA等多糖合成的前體，因此，HA寡糖在食品保健以及醫藥領域具有重要的應用前景。目前，雖然已有報道采用從頭合成的方法來制備HA寡糖，但由于化學合成存在底物昂貴、步驟繁瑣以及合成效率低等多問題，難以實現HA寡糖制備應用。相比較，酶法催化合成HA寡糖是一種很有潛力的方法，但需要制備大量的透明質酸酶液和控制反應條件。因此，將微生物發酵生產HA和透明質酸酶(Hyaluronidase,HAase)相偶聯，實現一菌發酵直接生產獲取HA寡糖和透明質酸酶兩種產物，具有一定的研究意義和工業化潛力。

HA廣泛地存在于各種動物組織內，如雞冠、關節滑液、軟骨、眼玻璃體等，同時發現HA也存在于產氣桿菌、綠膿桿菌和A、B、C溶血性鏈球菌等部分細菌中。由于動物提取工藝復雜、效率低以及存在病毒種間交叉感染和其它風險性的感染，近些年以來，透明質酸的獲取已經普遍由傳統的動物組織提法轉變為微生物發酵法，而應用最廣的是致病性弱的溶血性鏈球菌C族菌，如Streptococcus?equi和S.zooepidemicus，而且微生物發酵法獲得的HA多為大分子量的HA。隨著DNA重組技術、DNA測序技術以及代謝工程的發展，構建重組工程菌株合成HA也引起了廣泛關注。在過去幾年里，雖然微生物發酵合成HA已經獲得普遍的應用，然而微生物發酵法獲得的HA的分子量多為大分子量的HA和中分子量的HA，而直接發酵合成小分子HA尚無報道。如何構建微生物重組菌株合成不同分子量HA、尤其是小分子量HA已經成為迫切需要解決的問題。

隨著小分子HA和HA寡糖的研究與應用迅速興起，近些年以來，國內外開始重視HA的降解及其降解產物的制備研究。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化學降解、生物降解3大類。物理降解方法主要有加熱、機械剪切力、紫外線、超聲波、⁶⁰Co照射、γ-射線輻射等因素均可使HA發生降解。但是，物理法制備的HA分子量普遍高于1萬以上，產生的分子量范圍分布較大，產品穩定性較差。HA的化學降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和堿水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉(NaClO)和過氧化氫(H₂O₂)。盡管使用化學降解方法降解產物的相對分子質量可以通過改變酸堿或氧化劑的加入量和反應時間來控制，降解成本較低，易于大規模生產，但化學降解法引入了化學試劑，反應條件復雜，易給HA性質產生影響和產品的純化帶來困難，且產生大量的工業廢水。生物酶法降解是HA在透明質酸酶(HAase)的作用下，糖鏈上的糖苷鍵斷裂發生降解。酶解法是溫和的降解方法，不但可以制備小分子HA，而且利用此方法可制得鏈長為4～22的寡糖，而且經過凝膠色譜分離后可以制得單一HA寡糖。但是，目前商品化的透明質酸酶價格昂貴，不適合應用于工業化制備小分子HA。

透明質酸酶(Hyaluronidase,HAase)，是廣泛分布于自然界中的一類可降解透明質酸的酶的總稱。根據HAase的來源、結構和作用機制，HAase可以分為三類：內切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC?3.2.1.35，主要存在于哺乳動物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等毒液)、內切-β-葡萄糖醛酸苷酶(EC?3.2.1.36，主要存在于水蛭)以及透明質酸裂解酶(EC?4.2.2.1，主要存在于細菌、噬菌體以及真菌)。透明質酸酶作為“擴散因子”在臨床上被廣泛應用于藥物擴散助劑,而目前商品化的透明質酸酶主要以牛睪丸組織提取制備，產品質量差，價格昂貴和具有動物疫源感染風險。