[發(fā)明專利]裂殖壺菌α-微管蛋白相關(guān)序列及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410552945.4
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN105567715B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴小軍;許駿;謝文嫻
• 申請（專利權(quán)）人: 豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/29;C07K14/415;C12N15/80;C12Q1/6895
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發(fā)明涉及裂殖壺菌α?微管蛋白相關(guān)序列及其應(yīng)用，具體涉及SEQ ID NO:1所示的裂殖壺菌α?微管蛋白基因序列、SEQ ID NO:2所示的裂殖壺菌α?微管蛋白序列和SEQ ID NO:3所示的裂殖壺菌α?微管蛋白基因3’端非編碼區(qū)序列。本發(fā)明還涉及這些基因序列的片段，含有所述基因序列或其片段的重組核酸分子，這些重組核酸分子在同源重組中的應(yīng)用，以及應(yīng)用這些重組核酸分子進(jìn)行基因功能分析的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及裂殖壺菌α-微管蛋白相關(guān)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

裂殖壺菌(Schizochytrium sp)生長迅速，生物量能達(dá)到200g/L，DHA產(chǎn)率可達(dá)0.69g/L.h(CN 1416320A)。如果它既能生產(chǎn)酶蛋白，又保持如此高的生長性能，顯然是極佳的工程菌組。能高密度發(fā)酵、生長快速、胞外蛋白很少，裂殖壺菌具有成為外源基因表達(dá)宿主的潛力。

國內(nèi)外利用裂壺藻表達(dá)外源基因的公開，如Bayne等人胞外表達(dá)重組紅細(xì)胞凝集素(Hemagglutinin)[Bayne AC,Boltz D,Owen C等，Vaccination against influenzawith recombinant hemagglutinin expressed by Schizochytrium sp.confersprotective immunity,PLOS,8(4)]；CN102648207A公開的SexI分泌信號介導(dǎo)的分泌表達(dá)；CN 102220369農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化GUS基因、EGFP基因在裂殖壺菌TI01101中的表達(dá)；US7759097公開了使用延長因子(Elongation factor 1α)、肌動蛋白(actin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因的終止子和基于18S rDNA核酸序列的同源整合策略。在裂壺藻中表達(dá)脂肪酶的尚無報(bào)道。

當(dāng)前，國內(nèi)外僅公開有微管蛋白啟動子、Labyrinthμlomycota的表達(dá)系統(tǒng)，使用延長因子(Elongation factor 1α)、肌動蛋白(actin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因的終止子和基于18S rDNA核酸序列的同源整合策略。同源整合方式將外源核酸載體引入基因組中，肯定會改變整合位點(diǎn)處的序列和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因失活或表達(dá)水平改變。如，以啟動子(一般為啟動子區(qū)域下游的一段)為同源整合位點(diǎn)，顯然將會使該基因編碼區(qū)域遠(yuǎn)離啟動子原始位置，從而遠(yuǎn)離用于重組的那段啟動子區(qū)上游可能的表達(dá)調(diào)控元件，細(xì)胞生長受到影響幾乎是肯定的；以編碼基因作為同源位點(diǎn)，該基因會失活。此外，還有以rDNA作為整合位點(diǎn)的，但rDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，以18S作為同源整合位點(diǎn)，可能會對細(xì)胞生長造成影響。在大多微生物中，這種差異或許不太重要。但裂壺藻可積累DHA，生物量產(chǎn)率對DHA產(chǎn)率非常重要，因而表達(dá)外源基因的同時(shí)，應(yīng)該盡量不抑制菌體的生長。已有的發(fā)明、技術(shù)公開卻未談及重組后裂壺藻的生長變化。

真核生物以基因組為模板，轉(zhuǎn)錄出的mRNA通常包含5’帽、編碼部分、3’UTR、AAUAAA位點(diǎn)、AAUAAA后10-30bp的polyA位點(diǎn)以及poly(A)尾端(吳乃虎.基因工程原理，北京：科學(xué)出版社,2001第二版)，其中AAUAAA是mRNA前體從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上解離以及多聚腺苷酸化(poly(A))修飾需要的識別位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)具有高度保守性(Benjamin Levin.GENESⅧ，Upper Saddle River:Pearson Prentice Hall,2004；李明剛，高級分子遺傳學(xué)，北京：科學(xué)出版社，2004第一版)。顯然，對應(yīng)上基因組，基因末端AATAAA位點(diǎn)之是基因正常表達(dá)必需的序列。以基因3’端polyA識別位點(diǎn)與終止密碼子之間的序列作為同源重組的位點(diǎn)，極可能會影響到該基因的表達(dá)，從而改變宿主細(xì)胞的生長特性。但以polyA位點(diǎn)之后的序列作為同源整合位點(diǎn)，或從終止密碼子到polyA位點(diǎn)的全部序列作為同源整合位點(diǎn)，理論上不會對宿主細(xì)胞造成影響。本發(fā)明得到了微管蛋白3’端進(jìn)1600bp，未發(fā)現(xiàn)存在AATAAA保守序列。