[發(fā)明專利]食清潔劑細(xì)小棒菌ZJB14001、鹵醇脫鹵酶基因、酶、工程菌及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410552622.5
• 申請(qǐng)日: 2014-10-17
• 公開（公告）號(hào): CN104357468A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳志強(qiáng);鄭裕國(guó);萬(wàn)南微;沈寅初
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/60
• 分類號(hào): C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/20;C12P13/00;C12P17/02;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及來(lái)源于食清潔劑細(xì)小棒菌(Parvibaculum?lavamentivorans?ZJB14001)菌株中的鹵醇脫鹵酶基因，及其重組表達(dá)載體、基因工程菌，及其在制備重組鹵醇脫鹵酶，制備手性鹵代醇、環(huán)氧化物和β--取代醇中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

鹵醇脫鹵酶(EC?4.5.1.X)，又稱鹵醇裂解酶，通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制可催化脂肪族和芳香族的鄰鹵代醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物，并釋放鹵素離子(圖1)；同時(shí)，在離子親核試劑(如N₃^-、NO₂^-、CN^-、SCN^-和OCN^-)存在時(shí)，鹵醇脫鹵酶可以高選擇性地催化親核試劑所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)的光學(xué)純的β-取代醇(圖2)，其中疊氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體。手性氨基醇是眾多醫(yī)藥中間體、精細(xì)化學(xué)品和生物活性物質(zhì)的重要前提物質(zhì)。硫氰酸根和氰酸根拆分環(huán)氧化物可獲得異硫氰酸和噁唑烷酮，它們?cè)诒粡V泛用于農(nóng)用化學(xué)試劑和高分子化合物的合成。

荷蘭學(xué)者Janssen依據(jù)序列同源性和底物特異性將鹵醇脫鹵酶分為3類(A、B和C)。鹵醇脫鹵酶保守的催化三聯(lián)體Ser-Tyr-Arg參與催化反應(yīng)，其中Ser與底物羥基氧原子形成氫鍵，穩(wěn)定底物與酶的結(jié)合，Arg奪取Tyr酚羥基上的一個(gè)氫原子，從而降低Tyr的pKa。失去一個(gè)氫原子的Tyr酚羥基氧作為親核試劑，奪取底物羥基上的氫原子，使得底物羥基氧負(fù)離子親核進(jìn)攻鄰位碳鹵鍵，釋放鹵離子，形成環(huán)氧化物。

近年，已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了鹵醇脫鹵酶，如Agrobacterium?radiobacter?AD1，Agrobacter?sp.AD2，Corynebacterium?sp.N-1074，Agrobacterium?tumefaciens，Arthrobacter?erithii?H10a，Alcaligenes?sp.DS-K-S38和Pseudomonas?sp.DS-k-2DI等。部分鹵醇脫鹵酶的基因已被克隆表達(dá)和表征，并應(yīng)用于催化合成環(huán)氧化合物及β-取代醇。

美國(guó)CODEXIS早在2004年申請(qǐng)的一項(xiàng)專利WO2004/015132A2，發(fā)明了通過分子定向進(jìn)化技術(shù)，制備了一系列鹵醇脫鹵酶的突變體酶，并實(shí)現(xiàn)了鹵醇脫鹵酶在制備阿托伐他汀鈣側(cè)鏈關(guān)鍵中間體(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工業(yè)化應(yīng)用。巴斯夫歐洲公司在2007年申請(qǐng)的一項(xiàng)專利“利用鹵代醇從外銷旋環(huán)氧化物和氰酸鹽制備光學(xué)活性的5-取代的2-惡唑烷酮的方法”(CN?101437955A)，利用鹵醇脫鹵酶作為催化劑，氰酸鹽作為親核試劑，拆分環(huán)氧化物制備5-取代的2-惡唑烷酮。國(guó)內(nèi)安琪酵母股份有限公司在2008年申請(qǐng)的一項(xiàng)專利“鹵醇脫鹵酶突變體菌株、鹵醇脫鹵酶突變體及其制備方法和應(yīng)用”(CN?10760468A)，其通過定點(diǎn)突變技術(shù)獲得一個(gè)高活力的鹵醇脫鹵酶，然后研究確立了該突變體酶的發(fā)酵生產(chǎn)的最佳工藝條件。蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司在2012申請(qǐng)的一項(xiàng)專利“一種鹵醇脫鹵酶的生產(chǎn)方法”(CN?102634502A)，其主要工作是優(yōu)化了鹵醇脫鹵酶的發(fā)酵條件，將發(fā)酵酶活提高到900U/mL，專利中未涉及鹵醇脫鹵酶基因序列信息。

雖然鹵醇脫鹵酶在制備許多光學(xué)純的環(huán)氧化物和β-取代醇中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但是鹵醇脫鹵酶基因的稀少大大限制了鹵醇脫鹵酶的應(yīng)用。因此，開發(fā)研究新型的鹵醇脫鹵具有重要的理論研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

(三)發(fā)明內(nèi)容

鹵醇脫鹵酶基因序列較少，大部分關(guān)于鹵醇脫鹵酶應(yīng)用的專利申請(qǐng)都是圍繞鹵醇脫鹵酶HheC。本發(fā)明的目的是提供一種鹵醇脫鹵酶基因及其重組表達(dá)載體、基因工程菌，及其在制備鹵醇脫鹵酶；制備手性鹵代醇、環(huán)氧化物和β-取代醇中的應(yīng)用。本發(fā)明的主要內(nèi)容包括克隆表達(dá)了一種新型的鹵醇脫鹵酶基因；構(gòu)建了該鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，并轉(zhuǎn)化到對(duì)應(yīng)的宿主中獲得產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的重組工程菌；發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶并及將其應(yīng)用于鹵代醇、環(huán)氧化物和β-取代醇的制備。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種來(lái)源于食清潔劑細(xì)小棒菌(Parvibaculum?lavamentivorans)的鹵醇脫鹵酶HHDH-PL基因，所述鹵醇脫鹵酶HHDH-PL基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。