[發明專利]檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備及應用

無效

• 申請號: 201410549920.9
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104267187A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 于曉艷;耿嘉男;鄒穎剛;石艷;李相軍;孫波;苗春生;劉凱
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 長春市四環專利事務所(普通合伙) 22103
• 代理人: 郭耀輝

技術領域

本發明是一種急性腎臟損傷疾病的檢測方法，具體涉及一種應用免疫膠體金技術研制的Clusterin檢測試紙條，同時公開了其制備方法，屬于疾病檢測技術領域。

背景技術

急性腎損傷在臨床是常見而嚴重的腎臟病變，其發病率和死亡率都很高，尋求具有高敏感性、特異性、易檢測的新的腎損傷標志物一直是研究熱點之一。簇集蛋白(Clusterin)是一種分子量為80KD的異二聚體糖蛋白，廣泛存在于人類及動物的許多組織中，急性腎損傷(acute?kidney?in?jury,AKI)時，尿簇集蛋白表現出抗凋亡作用，并與脂肪利用、細胞聚集及黏附有關。雖然它在多種組織廣泛表達，但由于其相對分子質量較大，不能從腎小球濾過，因此只有在腎損傷時才能在尿中檢測。動物研究表明當腎毒素、腎切除術后、多囊肝性腎病和腎細胞瘤引起的急性腎損傷時，Clusterin能在腎損傷后的去分化腎細胞中表達增加，在鼠、狗和靈長類動物的尿中均可檢測出來。因此檢測尿中Clusterin水平可以間接評價急性腎損傷和藥物腎毒性的情況。

目前國內外檢測Clusterin的方法包括免疫組化、ELISA、Western?blot、PCR等，但用于臨床則存在很多弊端，如有創、操作程序復雜、時間較長等。

發明內容：

本發明的目的是公開一種用于檢測尿液Clusterin含量的膠體金試紙條及制備方法，用于急性腎損傷和藥物腎毒性安全性監測。

本發明提供的Clusterin的膠體金試紙條，適用于工業化生產，基本原理為雙抗夾心法，具體安裝方法參考了中國專利99203566.X、200510200394.6等，在硝酸纖維素膜的兩端分別設有金標墊和吸收墊，金標墊上端為樣品墊，金標墊包被有純化的單克隆Clusterin抗體1膠體金偶聯標記物，檢測線包被有純化的單克隆Clusterin抗體2，質控線包被有正常羊抗小鼠IgG抗體，質控線側貼有吸收墊。

本Clusterin的膠體金試紙條的制備，包括以下步驟：

1將自行制備的純化單克隆Clusterin抗體1用膠體金標記，噴點于玻璃纖維膜上制備成金標墊，將自行制備的純化單克隆Clusterin抗體2和正常抗小鼠IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上的檢測線處和質控線處，當被檢樣品中含有Clusterin抗原時，則于金標墊與膠體金標記的Clusterin抗體結合，并在吸收墊的作用下，向前滲透泳動，與檢測線上的Clusterin抗體再次結合，出現肉眼可見的色帶。

本發明試劑盒的使用方法如下：取尿標本約0.1-0.5ml加入小試管中，然后插入試紙條，待1-2分鐘反應帶清晰后觀察結果(見圖2)。出現1條紅色(對照)沉淀線，為尿檢診斷陰性；出現2條紅色(樣品和對照)沉淀線，為尿檢診斷陽性，未出現沉淀線則為無效。

本發明的積極效果在于：應用免疫膠體金技術制備Clusterin試紙條,可以快速，靈敏檢測尿中Clusterin蛋白含量，避免了復雜的操作，無需特殊檢測儀器，結果易于觀察判斷，可以適應多種檢測環境，無專業技術人員均可操作。樣本用量小，對操作者無毒性，并且檢測手段無創，除可用于臨床急性腎損傷的檢測還可用于藥物腎毒性安全性監測。制備試紙條所用單克隆抗體為雜交瘤技術自行制備，費用低。

附圖說明

圖1.為Clusterin檢測裝置示意圖；

圖2.為Clusterin試劑盒檢測結果判定示意圖；

圖中：1-樣品墊，2-金標墊，3-硝酸纖維素膜，4-吸水墊，5-PVC板，6-檢測線，7-質控線。

具體實施方式

實施例1Clusterin單克隆抗體的制備

用Clusterin蛋白(美國BD公司)多次免疫Balb/c小鼠，最后一次加強免疫后第3天取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞株X63-Ag8.653雜交融合(融合劑為聚乙二醇)，制備雜交瘤細胞，篩選能夠穩定分泌Clusterin單克隆抗體的細胞株制備抗Clusterin的單克隆抗體1、2，測定單克隆抗體1、2效價，ELISA驗證2者混合后效價疊加，證明1、2是針對Clusterin蛋白抗原上不同的抗原決定簇。

實施例2Clusterin膠體金試紙條的制備: