[發明專利]檢測新霉素的時間分辨熒光免疫試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201410548727.3
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN105572370A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 洪霞;江振飛;邢海龍
• 申請（專利權）人: 鎮江先創生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法。

背景技術

新霉素是一種廣譜抗生素，常用于動物各種傳染病的治療，對于多種病原菌有較強的抑制作用，對革蘭氏陽性和陰性菌皆有效。新霉素存在嚴重的副作用，具有腎毒性和內耳毒性，它對內耳的傷害，往往是不可逆轉的，因此動物食品中的新霉素殘留對人類的健康構成巨大威脅。近年來已在家禽養殖中禁止使用。但在實際養殖中仍存在獸藥亂用、濫用的現象。

新霉素殘留分析一般使用氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）及氣相色譜質譜聯用技術（GC/MS），這些方法靈敏、準確，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復雜、繁瑣費時、檢測成本較高，而且需專業人員操作，很難滿足對樣品進行現場、批量、快速檢測的需要。因此，開發一種簡單快速、適用于獸藥殘留現場監控的分析方法具有重要的現實意義。

而時間分辨熒光免疫分析法（TR-FIA）由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對新霉素檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道。

發明內容

為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種動物組織中新霉素殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。

本發明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測蔬菜水果中新霉素殘留量。

本發明目的之一是這樣實現的：檢測新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、新霉素標準品溶液、抗新霉素的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。

本發明目的之二是這樣實現的：檢測新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于：

(1)免疫原的制備：將半抗原新霉素與牛血清白蛋白（BSA）偶聯，得到免疫原（新霉素-BSA）；

(2)包被原的制備：將半抗原新霉素與卵血清白蛋白（OVA）偶聯，得到包被原（新霉素-OVA）；

(3)單克隆抗體的制備：

a.用步驟(1)的免疫原（新霉素-BSA）免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗新霉素的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

b.以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗新霉素的單克隆抗體IgG；

c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；

(4)樣品的前處理及檢測：

取包被有包被原（新霉素-OVA）的多孔包被板，加入50μL的新霉素到各自的微孔中，加50μL以緩沖液稀釋的抗新霉素抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100μLEu³⁺-兔抗鼠抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，加200μL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據標準曲線計算樣品中的新霉素含量。

上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。

本發明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測新霉素。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面：第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗新霉素的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗新霉素的單克隆抗體IgG。第二，Eu³⁺標記抗體的制備。

本發明測定方法：測定的基礎是標記免疫反應。包被有新霉素-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗新霉素抗體，振蕩反應，游離的新霉素與微孔板上的新霉素-OVA競爭抗新霉素抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的新霉素抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu³⁺-兔抗鼠抗體,進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu³⁺-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發下發射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中新霉素的量。

本發明檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現場操作檢測，應用廣泛，該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。

具體實施方式