[發(fā)明專利]CemGPDH基因及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410547380.0
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104357415A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設計）人: 胡贊民;張丹;李帥;范成明;陳宇紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/81;C12N15/82;C12N15/79;C12N1/19;C12N1/13;C12N5/10;C12P7/64;C12R1/865;C12R1/89
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 吳小明

技術領域

本發(fā)明涉及一種甘油-3-磷酸脫氫酶基因GPDH及其應用。具體地，涉及該基因序列的獲得和酵母表達載體的構建，以及其顯著提高酵母脂肪酸含量方面的用途。

背景技術

目前，隨著傳統(tǒng)能源的過度消耗和日益增長的能源需求，能源問題日益嚴峻，可替代能源的研究和開發(fā)成為全球學者關注的熱點。生物柴油主要以大豆、麻瘋樹等油料作物、廢棄的廚余油脂、動物性脂肪以及基因工程改造過的微藻作為原材料加工成液體燃料，是可以替代傳統(tǒng)石油燃料的優(yōu)質新型可再生能源。而微藻由于含油量高，易于培養(yǎng)，單位土地油脂產量遠高于其他油料作物，被認為是最有潛力的能源資源之一。

微藻繁殖能力強，對生長環(huán)境要求低，易于培養(yǎng)，光合作用效率高，含油量高，但目前微藻油脂代謝途徑中關鍵酶基因的研究還相對較少^[1-2]。小球藻(Chlorella)是微藻中的一類，屬于綠藻門小球藻屬，是光合自養(yǎng)型球形單細胞綠藻，直徑大約3-8微米。小球藻繁殖能力很強，含有豐富的營養(yǎng)元素，例如蛋白質、油脂、多不飽和脂肪酸、維生素、礦物質、食物纖維、核酸及葉綠素等，還含有多種生物活性物質，例如糖蛋白、多糖。小球藻是少數(shù)幾個可用于大規(guī)模培養(yǎng)的微藻。

真核生物(例如小球藻)中，油脂的主要儲存形式是三酰甘油(TAG)，由甘油-3-磷酸(G3P)和脂酰輔酶A為前體合成。甘油-3-磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosphate?dehydrogenase，GPDH)催化糖酵解過程中產生的磷酸二羥丙酮(Dihydroxyacetone?phosphate，DHAP)與G3P之間的相互轉變，產物G3P是合成TAG的重要原料，因此，GPDH是連接糖代謝和脂代謝的關鍵酶。

G3P是由甘油磷酸化而來，在植物中，淀粉通常作為光合作用的終產物被儲存起來，甘油的主要來源是通過將淀粉分解的葡萄糖送入糖酵解過程，將糖酵解中間產物轉化為甘油。而在微藻中，有些種類的微藻在積累淀粉的同時會產生大量的甘油，作為光合作用的終產物儲存起來^[3]。因此，在微藻中，主要有兩條不同的甘油合成途徑，其一是利用光合作用直接合成甘油，另一條是通過分解儲藏物質，將淀粉及蔗糖分解成為6-磷酸果糖，后轉變?yōu)镈HAP，再由甘油-3-磷酸脫氫酶催化，生成G3P，最后通過去磷酸化作用生成甘油^[4-5]。從微藻GPDH在油脂合成代謝中的位置上來看，GPDH所催化的由DHAP轉變?yōu)镚3P的反應是甘油合成途徑的關鍵步驟，GPDH參與了線粒體G3P穿梭，為呼吸鏈提供電子，是G3P合成的關鍵酶之一，而G3P是TAG和磷脂合成的重要原料，并且GPDH連接了糖代謝和脂代謝，對植物體內油脂合成和能量代謝有重要作用。

根據(jù)GPDH在細胞內位置不同，將其分為三種類型同工酶——細胞質型GPDH(ctGPDH)，葉綠體型GPDH(cpGPDH)和線粒體型GPDH(mGPDH)。每種同工酶在細胞內偏好催化DHAP與G3P之間相互轉變的正反應或逆反應，輔酶類型不同(以FAD或NADH/NADPH作為輔酶)，受不同條件誘導表達(滲透脅迫、熱激、油酸脅迫等)，并且在不同物種中目前已發(fā)現(xiàn)的GPDH同工酶數(shù)量不同^[5]。

發(fā)明內容

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將來源于橢圓小球藻的CemGPDH基因轉入釀酒酵母INVSC1后，可顯著提高其主要脂肪酸組分的含量。在INVScI主要的四種脂肪酸組分中，棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)含量變化不顯著，棕櫚油酸(C16:1)提高了15.57％，油酸(C18:1)提高了13.53％。酵母細胞總脂肪酸的含量也提高了約10.07％。已有物種GPDH基因的研究基本都選擇了酵母GPDH突變體來對其進行互補功能驗證，甚少有用野生型酵母的。本發(fā)明選擇野生型酵母在對橢圓小球藻GPDH基因進行功能驗證的同時還發(fā)現(xiàn)了其對油脂合成的顯著作用。在酵母中研究表明，CemGPDH基因轉酵母株與對照組(轉空載)相比，總脂肪酸含量提高了約10.07％，且其部分主要脂肪酸組分的含量也有明顯提高，其中棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)含量變化不顯著，棕櫚油酸(C16:1)提高了15.57％，油酸(C18:1)提高了13.53％。酵母細胞總脂肪酸的含量也提高了約10.07％。單個基因使得總脂肪酸及各不同脂肪酸的含量達到這種程度的實屬少見。

本發(fā)明提供了一個GPDH基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，這個基因來源于橢圓小球藻，該基因cDNA全長為1857bp。