[發明專利]一種抗MRSA群體感應agr系統反義脫氧核酶的應用

有效

• 申請號: 201410545851.4
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104293790B
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 侯征;羅曉星;薛小燕;李明凱;周穎;孟靜茹;達飛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K48/00;A61P31/04
• 代理公司: 北京中知法苑知識產權代理事務所(普通合伙)11226
• 代理人: 常玉明,張蘭海

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種抑制MRSA群體感應agr系統的反義抗菌脫氧核酶及其制備方法和應用。

背景技術

金黃色葡萄球菌與多種人類感染性疾病密切相關，如皮膚感染、呼吸道感染、甚至包括威脅生命的壞死性肌膜炎、壞死性肺炎等。目前治療MRSA最有效的藥物是萬古霉素，然而隨著耐萬古霉素MRSA的出現，人們即將面臨無藥可用的境地，因此尋找新的特異性抗MRSA感染的新靶點及新策略成為細菌感染治療領域的研究熱點和難點。

人類濫用抗生素是導致細菌發生耐藥的最主要原因之一，在持續的抗生素選擇性壓力作用下，細菌耐藥是一個必然發生的事件，每一種新的抗生素一經問世，很快便會產生耐藥。探索和研制不易誘導細菌產生耐藥的抗菌新策略和新藥物是當今世界各國科學家必須面對的緊迫研究課題。群體感應系統是廣泛存在于細菌內的一種群體行為調控機制，它不僅控制細菌間的信息交流和細菌的多種生命活動，而且也是致病菌生物被膜形成、毒力因子釋放、致病力大小，以及耐藥性發生的重要調控系統。

agr是金黃色葡萄球菌主要的群體感應系統，控制著許多毒力基因的表達，與細菌的致病力密切相關。agr是一個雙組份信號系統，由AgrA，AgrB，AgrC，AgrD及效應分子RNAIII構成。RNAIII是一個具有復雜二級結構的調節性RNA，在不同的葡萄球菌中RNAIII的結構高度保守。RNAIII一方面編碼26個氨基酸的δ-溶血素，另一方面能夠調節個別胞外蛋白和多功能調節子的轉錄。

反義抗菌劑突破以細菌蛋白為靶點的經典研究思路，以細菌體內致病、耐藥、群體感應等相關基因為靶點，從阻斷相關基因的表達入手，進而達到抑制或殺滅細菌的作用，為抗耐藥菌治療帶來了新的希望。與經典的抗生素相比較，反義抗菌劑具備以下突出的優點：一、以細菌基因為靶點，特異性高；二、靶點明確，研發成本低，只需知道基因序列就可得到相應的反義藥物；三、生產成本低，用常規的寡核苷酸合成技術就能合成。因而反義抗菌劑被認為是抗耐藥菌感染最有希望的突破口，代表著21世紀分子治療領域革命性的進展。

10-23型脫氧核酶能在RNA的A-U位點切割，可切割任何mRNA的起始密碼AUG，從而調控蛋白質的表達。10-23型脫氧核酶是一種潛在的強有力的RNA特異性切割工具，在體外可應用于RNA限制性內切酶，在生物系統內，可在RNA水平上阻斷靶基因表達。

發明內容

本發明的目的在于通過對MRSA群體感應agr系統效應分子RNAIII mRNA為靶點進行研究，提供一種反義脫氧核酶抗金黃色葡萄球菌agr系統的應用。

本發明的目的是這樣實現的：

一種反義抗菌脫氧核酶DNAzyme23，序列為5′-TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACAA-3′，其中A為腺嘌呤核苷酸單體，T為胸腺嘧啶核苷酸單體，C為胞嘧啶核苷酸單體，G為鳥嘌呤核苷酸單體；下劃線所示序列為10-23型脫氧核酶的催化核心；所有核苷酸均進行硫代修飾。

本發明通過試驗研究DNAzyme23對MRSA菌株(LAC)群體感應agr系統效應分子RNAIII的影響，結果顯示DNAzyme23能濃度依賴性地抑制靶基因RNAIII的表達、顯著降低α-toxin的分泌。另外，功能學實驗表明，DNAzyme23處理組的細菌培養上清對兔紅細胞的裂解，與對照組相比明顯降低。根據這些試驗結果，本發明提供了上述反義抗菌脫氧核酶在制備抗耐藥菌的藥物中的應用。優選所述的耐藥菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

本發明所涉及的反義抗菌脫氧核酶具有如下優點和顯著的進步：以金黃色葡萄球菌agr群體感應系統RNAIII效應分子為靶點，具有高特異性、低毒、安全、不易誘導細菌耐藥性的增加等優點。能夠有效阻斷agr信號通路、并減弱細菌毒力。具體表現在：RT-PCR法檢測發現，DNAzyme23能劑量依賴性地抑制LAC菌株RNAIII基因的表達；Western blot顯示DNAzyme23能夠顯著降低α-toxin的分泌。

附圖說明

圖1DNAzyme對RNAIII表達變化的影響柱狀圖；***P＜0.001vs.control。

圖2DNAzyme23對α-toxin表達的影響柱狀圖；*P＜0.05vs.control；**P＜0.01vs.control；***P＜0.001vs.control。