[發明專利]檢測藍藻毒素的膠體金免疫層析試劑盒

無效

• 申請號: 201410545656.1
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104330568A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 陳蕓;盛媛;尤一雯;張雯
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;唐循文

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及檢測藍藻毒素的快速檢測試劑盒及膠體金免疫層析測試法，具體地說是一種應用競爭抑制原理的膠體金免疫層析法實現對樣品中藍藻毒素進行定量檢測的試劑盒。

背景技術

藍藻又名“藍綠藻”，在一些營養豐富的水體中，某些藍藻常于夏季大量繁殖形成“水華”。在引起水質惡化的同時，某些“水華”種類還會產生具有生物毒性的次生代謝產物，稱為“藍藻毒素”。這些藍藻毒素的釋放直接對魚類、人畜產生危害。例如，肝毒素即微囊藻毒素(microcystin)對公眾的健康危害極大，嚴重的甚至會引起死亡。因此，圍繞如何檢測、控制和消除藍藻毒素，各國的科學工作者開展了大量的研究工作。

對于藍藻毒素的檢測，早期通過構建相應的生物模型進行生物毒性實驗以檢測水體中是否有藍藻毒素存在。然而，較低的靈敏度、較高的實驗耗費以及生物毒性實驗帶來的一系列倫理問題，使得人們不得不選擇別的方法來對毒素進行診斷。隨著微量樣品分析儀器(如，HPLC、MALDI-TOF)的發展，依托這些儀器開發出多種用于檢測自然水體中藍藻毒素的方法。這些方法分析過程簡單快捷并且具有很高的靈敏度。然而，由于分析儀器對樣品的前處理有著很高的要求，因此在實際運用中，樣品的處理變得既費時又費力，并且昂貴的分析儀器和標準品也使得許多實驗室無法開展對藍藻毒素的診斷。同時，依靠免疫學和生物化學的方法開發出的診斷手段也逐漸運用于實驗室或自然環境水體中藍藻毒素的檢測。如，對肝毒素(microcystin和nodularin)進行檢測的ELISA方法、比色法(蛋白磷酸酶抑制劑)和細胞毒性診斷。然而，前述多種診斷方法，仍然存在實驗花費成本較高，時間較長，無法廣泛應用的弊端。

近年來，在藻毒素的暴露與效應關系研究中，利用分子生物學、免疫學技術建立快速靈敏、特異檢測方法，?已成為該領域的熱點難點課題。膠體金免疫標記檢測技術(?colloidal-gold?immunolabeled?technique?，?CGIT?)是目前快速檢測領域中的前沿技術之。自該技術出現以來發展十分迅速，應用也越來越廣泛，目前幾乎可應用于生物醫學各研究領域，尤其是在醫學檢驗中使用得更加普遍。該技術經過多年的使用，顯示了眾多的優勢：操作簡單易行，無需特殊設備，無毒無污染等。

發明內容

解決的技術問題：為解決背景技術中提到的方便測試藍藻毒素水平以便更加有力的控制各種由藍藻毒素引起的危害的方法的需求，本發明提供了一種簡單、可靠、成本低廉、靈敏度高的快速檢測藍藻毒素的膠體金免疫層析試劑盒。

技術方案：檢測藍藻毒素的膠體金免疫層析試劑盒，包括黏貼支架，在黏貼支架上方從左到右依次設有樣本墊、金結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；在硝酸纖維素膜上中間部位從左到右設有一道檢測線和一道控制線；所述的樣本墊材質為玻璃纖維膜，經過含Tris、酪蛋白鈉鹽和PVP-10的處理液進行浸泡處理過夜；所述的金結合物墊由含Tris、S-17和牛血清白蛋白的處理液浸泡處理，含有膠體金抗藍藻毒素抗體交聯物；所述的硝酸纖維素膜上的檢測線為包被有固相化的藍藻毒素半抗原的T線；所述的硝酸纖維素膜上的控制線為包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線。

所述的T線包被的固相化的藍藻毒素的量高于樣本中能與金結合物墊中膠體金交聯抗體的藍藻毒素的量。

所述的黏貼支架為長條形。

固相化的藍藻毒素半抗原的T線的制備方法為將膠體金的pH調節到7.4之后再加入藍藻毒素單克隆抗體，使膠體金穩定的最低蛋白濃度最低為0.03mg/mL，將2.5mL稀釋在0.04mg/mL的0.01mol/l?PBS中，pH=7.4的藍藻毒素單克隆抗體，逐滴加入2.5mL膠體金溶液中，所得混合液在4℃下孵育2小時并且通過離心離去未結合的單克隆抗體，所得的沉淀物在5mL?pH=7.4的PBS中重懸，保存于4℃。藍藻毒素半抗原用PBS稀釋成1.0mg/mL,以噴量1.0μL/mm將抗原點于硝酸纖維膜上的T線，37攝氏度烘箱烘24h。

包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線的制備方法為羊抗鼠抗體1.0mg/mL被分配到硝酸纖維膜上的C線，37攝氏度烘箱烘24h。