[發(fā)明專利]一種熒光染料探針

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410545164.2
• 申請(qǐng)日: 2014-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104479668A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張玉慧;駱清銘;潘登;樊鋒凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C09K11/06
• 分類號(hào): C09K11/06;C07K19/00;G01N21/64
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 曹葆青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于顯微成像領(lǐng)域，更具體地，涉及一種熒光染料探針。

背景技術(shù)

活細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的熒光標(biāo)記目前有兩種可實(shí)現(xiàn)形式，熒光蛋白標(biāo)記及熒光染料標(biāo)記。其中，熒光蛋白的應(yīng)用最為廣泛。以熒光染料標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白，需要克服特異性標(biāo)記以及活細(xì)胞內(nèi)源性標(biāo)記的難題，目前被成功運(yùn)用的標(biāo)記手段很少。然而，熒光染料普遍亮度更高，有更優(yōu)秀的抗漂白能力及光穩(wěn)定性，而且有著更寬廣的發(fā)射光譜覆蓋區(qū)域，可以輕易地滿足各種顏色的普通熒光成像。不僅如此，在普通光學(xué)成像無(wú)法突破分辨率極限的領(lǐng)域，即超分辨顯微成像領(lǐng)域，熒光染料有著更加明顯的優(yōu)勢(shì)：染料的高亮度直接反應(yīng)在更高的超分辨成像的定位精度上，因而可以獲取更高的空間分辨率；穩(wěn)定的光物理性質(zhì)及抗漂白能力，更有著時(shí)間分辨率上的潛在優(yōu)越性。因此從顯微光學(xué)成像，包括普通熒光成像及超分辨顯微熒光成像角度，熒光染料標(biāo)記的活細(xì)胞內(nèi)源性肌動(dòng)蛋白都有著廣泛的應(yīng)用前景。

目前可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞標(biāo)記的方式有兩類：一類在體外將肌動(dòng)蛋白與熒光染料連接并純化，通過(guò)微注射等方式將這部分標(biāo)記蛋白導(dǎo)入到活細(xì)胞內(nèi)，利用肌動(dòng)蛋白在活細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)組裝的特性，達(dá)到活細(xì)胞肌動(dòng)蛋白標(biāo)記目的。這種方式雖然可以整合到內(nèi)源性蛋白，但它需要依賴特殊的設(shè)備及技術(shù)支持，很難廣泛被采用。另外，這種方式受到技術(shù)本身的應(yīng)用限制，例如微注射時(shí)需要選擇尺寸比較大的細(xì)胞系，因此只能在部分細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)。另一類即標(biāo)簽蛋白/肽技術(shù)，技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要將兩個(gè)部分分別以不同方式導(dǎo)入到活細(xì)胞內(nèi)：首先將一段標(biāo)簽蛋白/肽與肌動(dòng)蛋白形成融合基因，通過(guò)轉(zhuǎn)染方式將此部分導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。再將一個(gè)特定的小分子與熒光染料共價(jià)結(jié)合，此部分與活細(xì)胞孵育后自行透膜。后一部分的特殊的小分子可以與前一部分的的標(biāo)記蛋白/肽特異性結(jié)合，以此達(dá)到以熒光染料標(biāo)記肌動(dòng)蛋白的目的。然而，這種方式的應(yīng)用范圍很受限制。因?yàn)閷?shí)際應(yīng)用中，后一部分的透膜能力受到染料種類和細(xì)胞系的限制，只有少數(shù)的幾個(gè)熒光染料與小分子共價(jià)結(jié)合后的復(fù)合物能夠自行穿透細(xì)胞膜，而且對(duì)于不同的細(xì)胞系，復(fù)合物透膜能力的差別比較大。另外，以這種方式標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白是外源性的肌動(dòng)蛋白，即細(xì)胞內(nèi)本身的內(nèi)源性肌動(dòng)蛋白并沒(méi)有被標(biāo)記上。

目前，并沒(méi)有出現(xiàn)一種普適性的熒光染料標(biāo)記方法，能夠解決熒光染料在標(biāo)記肌動(dòng)蛋白時(shí)特異性標(biāo)記以及活細(xì)胞內(nèi)源性標(biāo)記的技術(shù)問(wèn)題，用以活細(xì)胞的內(nèi)源性肌動(dòng)蛋白的熒光成像，包括普通的熒光成像以及進(jìn)一步提高光學(xué)成像分辨率的超分辨顯微成像。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種熒光染料探針，其目的在于通過(guò)將穿膜肽、肌動(dòng)蛋白識(shí)別基團(tuán)以及熒光染料以特定的連接基團(tuán)及連接方式組合在一起形成具有穿膜能力的熒光染料探針，由此解決熒光成像領(lǐng)域中熒光染料對(duì)活細(xì)胞內(nèi)源性肌動(dòng)蛋白標(biāo)記的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種熒光染料探針，所述熒光染料探針具有式(I)的結(jié)構(gòu)：

MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK-R₁-GG-rRrRrRRR

式(I)

其中，MGVADLIKKFESISKEE為肌動(dòng)蛋白識(shí)別基團(tuán)的氨基酸序列；GGGGK為第一連接基團(tuán)；R₁為熒光染料基團(tuán)；GG為第二連接基團(tuán)；rRrRrRRR為細(xì)胞穿膜肽的氨基酸序列，r為D型精氨酸，R為L(zhǎng)型精氨酸。

優(yōu)選地，所述熒光染料探針，其熒光染料基團(tuán)R₁為羅丹明類染料、熒光素類染料或光開(kāi)關(guān)熒光染料。

優(yōu)選地，所述熒光染料探針，其所述羅丹明類染料為羅丹明B。

優(yōu)選地，所述熒光染料探針，其所述熒光素類染料為異硫氰酸熒光素。

優(yōu)選地，所述熒光染料探針，其所述光開(kāi)關(guān)羅丹明B，具有式(II)的結(jié)構(gòu)，

總體而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果：

(1)由于解決了熒光染料特異性與熒光探針透膜性的問(wèn)題，能夠特異性標(biāo)記到活細(xì)胞內(nèi)源性的肌動(dòng)蛋白；

(2)由于將熒光染料的應(yīng)用范圍擴(kuò)大到光開(kāi)關(guān)的熒光染料，能夠在實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)源性肌動(dòng)蛋白熒光成像之后，得到具有更高分辨率的超分辨顯微成像；

(3)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的光開(kāi)關(guān)羅丹明B標(biāo)記的熒光探針，具有優(yōu)秀的免激活及抗漂白的超分辨顯微成像能力。

附圖說(shuō)明